分子生物學(xué)學(xué)習(xí)資料：answer-ch8

8.3.給出一個(gè)模型來解釋T7噬菌體如何控制其轉(zhuǎn)錄。答：T7噬菌體，不同于枯草桿菌中的SPO1產(chǎn)生新的σ因子來改變寄主RNA聚合酶從早期到后期的特異性，而是編碼新的RNA聚合酶特異性地繼續(xù)表達(dá)噬菌體基因。1)前期轉(zhuǎn)錄（classI）利用的是寄主RNA聚合酶全酶，前期噬菌體蛋白質(zhì)產(chǎn)物中包含有T7RNA聚合酶。2)后期轉(zhuǎn)錄（classIIandIII）利用前期轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物T7RNA聚合酶繼續(xù)后面的基因轉(zhuǎn)錄過程。8.4.描述一個(gè)實(shí)驗(yàn)說明在枯草桿菌中，σE因子特異性識(shí)別孢子生長(zhǎng)的0.4-kb啟動(dòng)子，而σA識(shí)別的是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的啟動(dòng)子。答：用分別含σA或σE的RNA聚合酶對(duì)質(zhì)粒p213進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。將EcoR1-Hinc11質(zhì)粒片斷進(jìn)行DNA印跡，再用以上標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分別對(duì)其雜交（記為lane1,lane2）。通過放射自顯影可看到：lane1上只有一條帶，根據(jù)電泳位置可判斷轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與3050-bp的片斷進(jìn)行了雜交；而lane2上有兩條帶，表明轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與3050-bp和770-bp的片斷雜交了。由于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的啟動(dòng)子序列和孢子形成的啟動(dòng)子序列分別位于3050-bp和770-bp的片斷上，可知σA只轉(zhuǎn)錄了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的基因，而σE對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的基因和孢子形成的基因都進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄。8.5.概括枯草桿菌細(xì)胞在形成孢子過程中改變轉(zhuǎn)錄體系的機(jī)制。答：當(dāng)枯草桿菌孢子形成時(shí)，一套特異性的孢子形成基因被激活，而很多，但不是全部，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的基因停止被轉(zhuǎn)錄。一些新的σ因子取代了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的σ因子，來指導(dǎo)孢子形成基因的轉(zhuǎn)錄。每個(gè)σ因子都有其特別的啟動(dòng)子識(shí)別序列。8.6.如何得知在枯草桿菌的孢子形成過程中，σK是由兩個(gè)基因經(jīng)過重組形成一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物？答：σK是由spoIVCB和spoIIIC兩基因經(jīng)過重組形成sigK基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。通過對(duì)這3個(gè)基因進(jìn)行測(cè)序，便可得出上述結(jié)論。spoIVCB----GCGQGGTGTATTGAAAATGAGATTGT-----spoIIIC-----------------------ATGAATAATGAAATCCTCATGCAT---sigK ----GCGQGGTGTATTGAAAATGAAATCCTCATGCAT---8.7描述一個(gè)實(shí)驗(yàn)說明在枯草桿菌中，σE因子識(shí)別spoIID啟動(dòng)子序列，而其它σ因子無法識(shí)別該序列。答：在coreRNApolymerase中分別加入σE或σB與σC，然后對(duì)含spoIID啟動(dòng)子序列的限制性片斷進(jìn)行失控轉(zhuǎn)錄。對(duì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行電泳，可看出只有含σE的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出長(zhǎng)度約700個(gè)核苷酸的產(chǎn)物，即由spoIID啟動(dòng)子得到的失控轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。說明只有σE識(shí)別spoIID啟動(dòng)子序列。8.9為什么說AnabaenaGlu合成酶基因含有兩個(gè)不同的啟動(dòng)子在調(diào)控上具有優(yōu)勢(shì)？答：Anabaena7120是一種細(xì)胞排列成長(zhǎng)鏈狀的藻青菌，或藍(lán)綠藻。在NH4+有效時(shí)，這些細(xì)胞可以全部生長(zhǎng)；但是當(dāng)NH4+供應(yīng)不足，一些有生長(zhǎng)力的細(xì)胞分化為可以為其他細(xì)胞固定氮的異性細(xì)胞。在固氮條件下，大多數(shù)異性細(xì)胞中的活性基因被切斷，同時(shí)固氮基因啟動(dòng)。這種轉(zhuǎn)變的主要機(jī)理是一個(gè)σ-因子中的轉(zhuǎn)換。識(shí)別基因的大腸桿菌狀啟動(dòng)子的σ被一個(gè)對(duì)nif啟動(dòng)子具特異性的固氮s取代。然而一些活性基因在固氮的過程中也必須保持其活性。在這些谷氨酰胺合成酶基因中，通過向谷氨酸鹽添加NH4+，谷氨酰胺合成酶制造出有生長(zhǎng)力以及固氮細(xì)胞中都需要的aminoacidglutamine。在兩種情況下，glnA基因在下述機(jī)理下保持活性，即glnA基因有兩個(gè)啟動(dòng)子，每一個(gè)作用于一個(gè)σ-因子，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與這兩個(gè)啟動(dòng)子結(jié)合，活性起始位點(diǎn)位于nif-like起始位點(diǎn)上游62bp處。8.10為什么說大腸桿菌Glu合成酶基因含有兩個(gè)不同的啟動(dòng)子在調(diào)控上具有優(yōu)勢(shì)？答：大腸桿菌的glnA基因的調(diào)節(jié)在某種意義上說也是依賴固定氮的有效性。當(dāng)碳是限制因素時(shí)，小型蛋白可以合成，故對(duì)谷氨酰胺的需求較小。在這種情況下，基因從一個(gè)較弱的啟動(dòng)子glnAP1開始，靠主要全酶Eσ70轉(zhuǎn)錄。從另一方面來講，當(dāng)固定氮是限制因素時(shí)，大量需要谷氨酰胺合成酶，在谷氨酰胺中盡可能多地誘導(dǎo)有效的NH4+。谷氨酰胺于是為其他細(xì)胞中物質(zhì)提供氨基。在這樣的情況下，glnA從一個(gè)位于glnAP1下游115bp的強(qiáng)啟動(dòng)子glnAP2開始，通過Eσ54轉(zhuǎn)錄。這樣，自弱啟動(dòng)子到強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)換的支配就由σ54代替主要的σ70完成。8.11描述一個(gè)模型解釋大腸桿菌在熱激反應(yīng)中快速響應(yīng)。答：熱激反應(yīng)在不到一分鐘內(nèi)即可開始，而如此短時(shí)間不夠一個(gè)新的s-因子合成。這樣就有理由想到有一個(gè)先前存在的σH，它可以突然暴露，更有效地與σ70(σA)競(jìng)爭(zhēng)到核心聚合酶。8.12λ噬菌體的裂解循環(huán)中的前早期-延遲早期-晚期轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)換是怎樣進(jìn)行的？答：λ噬菌體的裂解循環(huán)中的前早期-延遲早期-晚期轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)換受抗終止因子控制。兩個(gè)前早期基因之一，即編碼cⅠ基因抑制者的cro，保證溶菌性循環(huán)的繼續(xù)。另一個(gè)基因產(chǎn)物，N，是一個(gè)允許RNA聚合酶忽視前早期基因終止子的作用而進(jìn)入延遲早期轉(zhuǎn)錄階段的一個(gè)抗終止因子。延遲早期基因中的Q編碼另一個(gè)抗終止因子（Q）。它可以識(shí)別暫停轉(zhuǎn)錄的復(fù)合體并且綁定在qut位點(diǎn)。然后Q與聚合酶綁定并改變它，通過這種方法忽略終止子并恢復(fù)轉(zhuǎn)錄，繼續(xù)進(jìn)入晚期。8.13給出一個(gè)模型說明N蛋白引起的抗終止作用在裂解生長(zhǎng)的晚期過程中的作用，涉及到哪些蛋白？答：Fig.8.13在N-directedantitermination的模型及其所涉及的蛋白如圖所示,五種蛋白(N,NusA,NusB,NusG,andS10)參與了立即早期轉(zhuǎn)錄(immediateearlytranscription)的抗終止作用。NusA和S10結(jié)合在RNApolymerase上,N和NusB分別結(jié)合在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物nut位點(diǎn)的區(qū)域boxB和boxA上。N和NusB分別結(jié)合在NusA和S10上，它們使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物附著在聚合酶上。聚合酶上的這些改變使之可以通讀過立即早期基因末端的終止子。Q對(duì)晚期基因的表達(dá)是必須的，Q結(jié)合在qut位點(diǎn)的Q-binding區(qū)域上，此區(qū)域處于latepromoter的下游。它同樣可以使聚合酶通讀過終止子，從而轉(zhuǎn)錄晚期基因。8.14ThePREpromoterisbarelyrecognizableandisnotinitselfattractivetoRNApolymerase.HowcanthecIgenebetranscribedfromthispromoter?答：PRE位于PR和cro的右側(cè)。它調(diào)控向左的轉(zhuǎn)錄：先通過cro之后通過cI。因此PRE使cI先于任何阻抑物表達(dá)。cro的自然轉(zhuǎn)錄方向是從PR起向右轉(zhuǎn)錄，所以這樣向左的轉(zhuǎn)錄使從PRE起的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是cro的“anti-sense”轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而是cI的“sense”轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。RNA的cI部分翻譯之后將會(huì)生成阻抑物，但是anti-sensecro將不會(huì)被翻譯。AntisenseRNA能對(duì)噬菌體的原溶性做出貢獻(xiàn)，因?yàn)閏roantisense的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以結(jié)合到cromRNA上，從而干擾mRNA的翻譯。8.15描述實(shí)驗(yàn)說明CII蛋白可以結(jié)合到λDNA的哪一區(qū)域？并給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。答：Fig.8.15CⅡ結(jié)合在λDNA的-35box區(qū)域上Ptashne和colleagues通過DNasefootprintanalysis來研究CII與兩個(gè)早期λ啟動(dòng)子（PRE(a)andPI(b)）的關(guān)系。圖(a)中，泳道1–4包含了如下用量的CII：泳道1，無；泳道2，10pmol；泳道3,18pmol；泳道lane4,90pmol。圖(b),泳道1–4包含了如下用量的CII：泳道1，無；泳道2，18pmol；泳道3,45pmol；泳道lane4,100pmol。左右兩個(gè)CIIfootprint的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這兩個(gè)啟動(dòng)子都包含了–35box，說明CⅡ結(jié)合在λDNA的-35box區(qū)域上。8.16圖示并解釋DNaseFootprinting技術(shù)，這一技術(shù)可以獲得什么信息？答：Fig.8.16(a)DNasefootprinting技術(shù)示意圖Fig.8.16(b)DNasefootprinting實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(b)中,泳道1–4包含了如下用量的蛋白：泳道1，無；泳道2，10pmol；泳道3,18pmol；泳道lane4,90pmol。DNasefootprinting（足跡法）是用來鑒定DNA或RNA的蛋白結(jié)合部位的一種技術(shù)。用核酸酶來消化放射標(biāo)記的有或沒有特定結(jié)合蛋白的核酸樣本,由于DNA或RNA帶結(jié)合蛋白的部位受到保護(hù)不被消化,因而受保護(hù)部分在凝膠電泳上看不到其片段,從而來鑒定蛋白的結(jié)合部位。8.17CII蛋白和RNA聚合酶如何同時(shí)作用于DNA的同一區(qū)域？答：Ptashne和coworkers的DMSprotectionexperimentswithCⅡ顯示和CⅡ接觸的堿基與和RNApolymerase接觸的堿基分別位于螺旋結(jié)構(gòu)的兩側(cè)。這就是說，這兩種蛋白分別結(jié)合在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩側(cè)，它們與DNA的結(jié)合是協(xié)同的而不是相互競(jìng)爭(zhēng)的。8.18設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)說明λrepressor如何正向和負(fù)向調(diào)控其自身的合成？這個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示了λrepressor對(duì)cro基因轉(zhuǎn)錄的有什么作用？答：λrepressor的結(jié)合位點(diǎn)為Or和OL，如下圖所示。兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都可以細(xì)分為三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，OR1,OR2,OR3，其中repressor與OR1的結(jié)合最緊密，與OR2的結(jié)合能力次之，與OR3的結(jié)合能力最弱。OR位于啟動(dòng)子PR和PRM之間，它可以控制向左轉(zhuǎn)錄，得到cI基因產(chǎn)物；也可以控制向右的轉(zhuǎn)錄，得到cro基因的產(chǎn)物；OR3位點(diǎn)就處在PRM之中。當(dāng)repressor存在時(shí)，repressor首先結(jié)合到OR1上，這個(gè)結(jié)合幫助其與OR2的結(jié)合，當(dāng)repressor與這兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，可以與結(jié)合在PRM上的聚合酶接觸，并促進(jìn)聚合酶從這個(gè)啟動(dòng)子開始向左轉(zhuǎn)錄，從而轉(zhuǎn)錄出更多的repressor，即正向調(diào)節(jié)其合成。當(dāng)轉(zhuǎn)錄生成的repressor過多時(shí)，大量的repressor也可以結(jié)合到OR3上，這時(shí)，聚合酶就不能與PRM結(jié)合，向右的轉(zhuǎn)錄被抑制，即負(fù)向調(diào)節(jié)其合成。同時(shí)，當(dāng)repressor結(jié)合到OR位點(diǎn)時(shí)，repressor起抑制PR啟動(dòng)子活性的作用，所以向右的轉(zhuǎn)錄不能進(jìn)行，即減少了cro基因的轉(zhuǎn)錄。圖8.18(A)λrepressor與OR的結(jié)合維持了溶原周期。Repressor結(jié)合到OR1和OR2位點(diǎn)時(shí)，可以促進(jìn)聚合酶與PRM的結(jié)合，并向左轉(zhuǎn)錄cI基因利用類似run-offtranscription的實(shí)驗(yàn)方法可以驗(yàn)證這個(gè)模型。以含有OR，PRM，PR，cro，cI各個(gè)位點(diǎn)的序列為模板，如下圖所示。實(shí)驗(yàn)中加入不足的UTP，因此轉(zhuǎn)錄進(jìn)行一段時(shí)間后會(huì)停止，得到未轉(zhuǎn)錄完全的片段。圖8.18(B)用于run-offtranscription的模板鏈，箭頭表示轉(zhuǎn)錄停止的位置。實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入不同濃度的repressor，檢測(cè)產(chǎn)物的長(zhǎng)度，如果向左轉(zhuǎn)錄cI基因，那么產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度為300nt，而如果向右轉(zhuǎn)錄cro基因，那么產(chǎn)物長(zhǎng)度為110nt。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)repressor濃度比較小的時(shí)候，產(chǎn)物中110nt片段的量就比較小，且隨著repressor濃度的升高，其量更加減小；而當(dāng)repressor濃度比較小的時(shí)候，可以看到有明顯的300nt長(zhǎng)度的產(chǎn)物生成，說明repressor濃度比較低時(shí)，可以促進(jìn)相左對(duì)cI的轉(zhuǎn)錄；而當(dāng)repressor的濃度比較高的時(shí)候，可以看到，300nt長(zhǎng)度的產(chǎn)物也消失，說明當(dāng)repressor濃度高時(shí)，對(duì)其自身的合成有負(fù)調(diào)控的作用。圖8.18(C)研究repressor對(duì)cI和cro轉(zhuǎn)錄的影響8.19說明利用基因相互抑制來研究蛋白間相互作用的原理。答：蛋白之間的相互作用主要是通過幾個(gè)關(guān)鍵的氨基酸來完成的，其中一個(gè)蛋白的基因發(fā)生突變，從而使一個(gè)氨基酸改變后，兩個(gè)蛋白即不能發(fā)生相互作用；然而通過改變另一個(gè)蛋白的基因，使第二個(gè)蛋白質(zhì)的一個(gè)氨基酸也發(fā)生改變，那么改變后，兩個(gè)蛋白質(zhì)可能再次發(fā)生作用。這就是基因間抑制的原理，一個(gè)基因的突變抑制了另一個(gè)基因突變所產(chǎn)生的影響。可以利用下圖來說明：圖8.19基因間抑制的原理。原repressor可以與聚合酶相互作用，當(dāng)repressor發(fā)生突變時(shí)，聚合酶不能與之相互作用，而當(dāng)聚合酶也發(fā)生相應(yīng)的突變時(shí)，兩者之間恢復(fù)相互作用8.20設(shè)計(jì)一個(gè)基因間抑制的實(shí)驗(yàn)，說明λrepressor與E.coli的σ因子之間的相互作用，并給出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。答：根據(jù)上題所述的實(shí)驗(yàn)原理，可以利用這個(gè)實(shí)驗(yàn)：在E.coli的染色體上插入兩個(gè)溶原噬菌體體的DNA片段，一個(gè)是含有cI位置pc突變的λ原噬菌體（λprophage），且cI基因位于弱啟動(dòng)子Plac的控制下，所以，這個(gè)原DNA可以表達(dá)突變型的repressor；另一個(gè)溶原噬菌體為P22噬菌體，這個(gè)噬菌體含有一個(gè)抗kanamycin基因，并且這個(gè)基因處在PRM,OR的控制下。再向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入含有rpoD基因的質(zhì)粒，這個(gè)基因可以轉(zhuǎn)錄一個(gè)與repressor相作用的σ因子。然后在含有kanamycin的培養(yǎng)基上培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。當(dāng)rpoD基因沒有突變或有一個(gè)不相關(guān)的突變時(shí)，rpoD基因的σ因子產(chǎn)物與核心酶結(jié)合但不能與repressor結(jié)合，所以不能轉(zhuǎn)錄抗kanamycin基因，細(xì)胞將會(huì)死亡；而當(dāng)rpoD基因有合適的突變，即可以與突變型的repressor互補(bǔ)的突變時(shí)，σ因子與核心酶結(jié)合，并與repressor結(jié)合，則可以轉(zhuǎn)錄抗kanamycin基因，所以細(xì)胞可以生存，這樣，不但可以驗(yàn)證λrepressor和σ因子的作用，還可以得知哪種突變是與repressor突變互補(bǔ)的。圖8.20利用基因間抑制驗(yàn)證λrepressor和σ因子的作用8.21建立一個(gè)模型說明λ噬菌體侵染E.coli細(xì)胞后，cI和cro基因?qū)τ诮⑷茉芷诤土呀庵芷诘母?jìng)爭(zhēng)。答：噬菌體侵染細(xì)胞后，在沒有repressor的條件下，轉(zhuǎn)錄早早期基因，可以得到N蛋白和cro基因的產(chǎn)物，其中N蛋白是一個(gè)反終止蛋白，其作用是繼續(xù)轉(zhuǎn)錄延遲早期基因；cro基因的產(chǎn)物Cro蛋白可以結(jié)合到OR3上，這樣就占據(jù)了PRM位點(diǎn)，所以聚合酶不能在此處向左進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，只能結(jié)合PR，并防止所有早期基因，包括cII和cIII基因，沒有了CII蛋白，就無法啟動(dòng)cI基因，所以不能合成repressor，即抑制了溶原周期。當(dāng)沒有N蛋白時(shí)，轉(zhuǎn)錄在早早期與延遲早期之間停止。就在cro基因的下游，含有cII基因——一個(gè)延遲早期基因，這個(gè)基因轉(zhuǎn)錄出CII蛋白，這個(gè)蛋白結(jié)合到cro基因右方的PRE啟動(dòng)子上，可以促進(jìn)聚合酶在此處結(jié)合，并向左轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而得到cI基因的產(chǎn)物repressor；同時(shí)向左的轉(zhuǎn)錄得到cro基因的反義RNA，這個(gè)反義RNA不能翻譯出Cro蛋白。Repressor結(jié)合到OR1和OR2上，對(duì)聚合酶結(jié)合PRM啟動(dòng)子，向左轉(zhuǎn)錄