ph的ph值法測定葡萄糖中微量葡萄糖

ph的ph值法測定葡萄糖中微量葡萄糖

葡萄糖的測定已經(jīng)報(bào)告。雖然檢測方法不同，但大多數(shù)方法都采用了相同的反應(yīng)機(jī)制。葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下被氧化分解為葡萄糖酸，并釋放二氧化水。然后通過降低或增加呼吸濃度來間接測定葡萄糖。這種方法通常具有很高的選擇性，但葡萄糖的固定化或電磁化過程復(fù)雜，酶柱或電磁化使用壽命短，成本高等。本實(shí)驗(yàn)采用了葡萄糖做還原劑,先將銀離子還原為銀,銀再將三價鐵離子還原為二價鐵離子,以鄰菲羅啉絡(luò)合顯色,用分光光度法測定。該方法簡單、易行且靈敏度較高。1實(shí)驗(yàn)部分1.1酸度計(jì)和溶劑722型可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司),電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠),PHS-3C型酸度計(jì)(上海大普儀器有限公司)。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液:0.0011mol/L;硝酸銀溶液:0.01mol/L;氫氧化鈉溶液:0.1mol/L;硫酸鐵銨溶液(0.1mol/L的硫酸為介質(zhì)):0.004mol/L;不同pH值和pH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液;0.1%的鄰菲羅啉溶液。所用試劑均為分析純,水為蒸餾水。1.2硫酸鐵銨鹽堿連環(huán)劑為單一溶劑移取一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL容量瓶中,依次加入0.5mL硝酸銀溶液,0.75mL的氫氧化鈉溶液,搖勻,沸水浴中加熱10min后,冷卻至室溫;依次加入0.75mL硫酸鐵銨溶液,2.5mL緩沖溶液,1.5mL鄰菲羅啉溶液,再在沸水浴中加熱20min,冷卻至室溫,以蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。用1cm比色皿于510nm波長處,以試劑空白為參比,測其吸光度。2結(jié)果與討論2.1繪制吸收曲線按實(shí)驗(yàn)方法測定標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同波長下的吸光度,繪制吸收曲線如圖1所示,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在λ=510nm處,絡(luò)合物[Fe(o_phen)3]2+具有最大的吸光度,因此選用510nm為測定波長。2.2加熱方式的確定葡萄糖與氧化銀的反應(yīng)在室溫下可以進(jìn)行,但重現(xiàn)性差,即使延長反應(yīng)時間,結(jié)果仍不穩(wěn)定。本文采用加熱的方式提高反應(yīng)速度,通過對不同溫度和不同時間的多次比較,發(fā)現(xiàn)前三種溶液加完后,在65℃以上水浴加熱10min,等加完全部溶液后,再在同溫下加熱20min,吸光度達(dá)到最大值且穩(wěn)定,考慮到加熱的便利性,選在沸水浴中加熱。2.3加入硝酸銀、鄰菲羅啉、硫酸鐵銨等聚合物液硝酸銀溶液的用量太少,難以生成沉淀,反應(yīng)不完全;用量太多,后續(xù)步驟中的沉淀不能溶解完全,出現(xiàn)輕渾濁現(xiàn)象影響測定。我們對硝酸銀做了以下研究,分別移取1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10只25mL容量瓶中,依次加入不同量的硝酸銀溶液,再加入0.75mL氫氧化鈉溶液,搖勻,在沸水浴中加熱10min,冷卻至室溫;依次加入0.75mL硫酸鐵銨溶液、2.5mL緩沖溶液、1.5mL鄰菲羅啉溶液,再在沸水浴中加熱10min,冷卻至室溫。以蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。以試劑空白為參比,由實(shí)驗(yàn)可以得出,在加入的1.0mL1.25mL硝酸銀溶液的容量瓶中,后續(xù)沉淀多且不穩(wěn)定,因此不適合。而硝酸銀溶液的用量選擇0.25mL、0.5mL、0.75mL時,幾乎沒有后續(xù)沉淀且穩(wěn)定,0.5mL時的吸光度最大,因此,綜上所述,硝酸銀溶液的用量應(yīng)選擇0.5mL比較合適。2.4液的用量的確定氫氧化鈉溶液的用量少,不利于葡萄糖與氧化銀反應(yīng);用量太大,后續(xù)步驟中將會出現(xiàn)氫氧化鐵沉淀,影響實(shí)驗(yàn)的測定。基于此,我們對氫氧化鈉溶液的用量進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):分別移取1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10只25mL容量瓶中,依次加入0.5mL硝酸銀溶液,再加入不同量的氫氧化鈉溶液,搖勻,在沸水浴中加熱10min,冷卻至室溫;依次加入0.75mL硫酸鐵銨溶液,2.5mL緩沖溶液,1.5mL鄰菲羅啉溶液,再在沸水浴中加熱10min,冷卻至室溫。以蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。以試劑空白為參比,由實(shí)驗(yàn)得知,氫氧化鈉溶液的用量選擇0.50mL為宜。2.5鐵銨溶液的配制由于硫酸鐵銨溶液配制時加有硫酸,起到防止鐵水解和溶解未反應(yīng)的氧化銀的作用,用量少氧化銀不能溶解;用量過多又影響吸光度的測定?；诖?對不同用量的硫酸鐵銨溶液進(jìn)行了測定。分別移取1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10只25mL容量瓶中,依次加入0.5mL硝酸銀溶液,再加入0.50mL氫氧化鈉溶液,搖勻,在沸水浴中加熱10min,冷卻至室溫;依次加入不同量的硫酸鐵銨溶液,2.5mL緩沖溶液,1.5mL鄰菲羅啉溶液,再在沸水浴中加熱10min,冷卻至室溫。以蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。以試劑空白為參比,由實(shí)驗(yàn)得知,在0.75mL硫酸鐵銨溶液用量合適并且具有最大的吸光度,所以選擇0.75mL硫酸鐵銨溶液用量。2.6鐵離子的還原實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)被測定液pH值在4~9范圍,測定的結(jié)果較為準(zhǔn)確,溶液酸度過高,不利于三價鐵離子的還原;酸度過低,會使鐵離子沉淀,同時造成鄰菲羅啉合鐵(Ⅱ)絡(luò)合物分解,影響顯色的靈敏度,造成測定的結(jié)果偏低。我們對不同酸度的溶液的吸光度進(jìn)行了多次研究,最終選用pH=4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液控制被測液的酸度。2.7鄰菲羅啉吸收劑用量的確定鄰菲羅啉溶液起到顯色的作用,我們用上述的方法對它進(jìn)行了研究:分別移取1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10只25mL容量瓶中,依次加入0.5mL硝酸銀溶液,再加入0.5mL氫氧化鈉溶液,搖勻,在沸水浴中加熱10min,冷卻至室溫,依次加入0.75mL硫酸鐵銨溶液,2.5mL緩沖溶液,不同量的鄰菲羅啉溶液,再在沸水浴中加熱1min,冷卻至室溫。以蒸餾水稀釋至刻度,搖勻。以試劑空白為參比,測其吸光度。結(jié)果可知,鄰菲羅啉溶液的用量大于1.5mL時的吸光度最大且穩(wěn)定,并且大于1.5mL時的吸光度相差不大,故本實(shí)驗(yàn)選用1.5mL鄰菲羅啉溶液的用量。3樣品分析3.1朗伯—工作曲線移取不同量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于數(shù)只容量瓶中,按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行顯色,繪制工作曲線如圖2所示,由圖2可知,葡萄糖的含量在0~88μg范圍內(nèi)符合朗伯—比爾定律,直線回歸方程為A=0.00813C+0.2026,r=0.9989。3.2鄰菲羅啉總總反應(yīng)時間的測定準(zhǔn)確移取葡萄糖注射液1.00mL于500mL容量瓶中,用蒸餾水釋至刻度線,搖勻,從中取0.5mL置于25mL容量