抗體依賴性感染增強(qiáng)作用在登革病毒致病機(jī)制中的作用

抗體依賴性感染增強(qiáng)作用在登革病毒致病機(jī)制中的作用

病毒登格病毒（denv）屬于黃毒科黃色病毒，具有傳染性膜黃色病毒。依據(jù)血清型差異可分為1～4型登革病毒。登革病毒能在人群中引發(fā)從輕微的發(fā)熱反應(yīng)、登革熱到危及生命的登革出血熱以及登革熱休克綜合征等一系列癥狀。目前,全球每年有100多個(gè)國家和地區(qū)的5000萬～1億人感染登革病毒,發(fā)病人群主要集中在亞洲、非洲及南美洲等熱帶及亞熱帶地區(qū),其中登革出血熱和登革熱休克綜合征是威脅生命的急性毛細(xì)血管滲漏綜合征,發(fā)病人數(shù)已接近50萬,在一些地區(qū)患病兒童的死亡率高達(dá)5%。近年來,隨著全球氣候變暖,登革熱在世界范圍內(nèi)的頻繁暴發(fā),尤其在東南亞以及我國南部和東南沿海地區(qū)其發(fā)病率及病死率急劇上升。登革病毒主要通過埃及伊蚊叮咬,經(jīng)宿主樹突狀細(xì)胞的特異性黏附受體樹突狀細(xì)胞特異性C型凝集素(DC-SIGN)感染細(xì)胞,誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。臨床發(fā)現(xiàn),登革出血熱和登革熱休克綜合征集中發(fā)生于再次感染異型登革病毒的人群中,同時(shí)攜帶母源性IgG登革抗體的嬰兒在初次感染登革病毒時(shí)也極易發(fā)病。1964年,Hawkes等首次在蟲媒病毒中提出了“抗體依賴性感染增強(qiáng)”(antibody-dependentenhancement,ADE)假說,表現(xiàn)為病毒在低濃度免疫血清中的復(fù)制被促進(jìn)而不被抑制,提示了ADE是登革出血熱和登革熱休克綜合征產(chǎn)生的主要因素。目前認(rèn)為所有登革病毒的中和抗體在一定的低濃度水平均有ADE,且異源抗體比同源抗體更易誘發(fā)ADE,尤其是第一次感染登革2型病毒時(shí)更容易產(chǎn)生ADE現(xiàn)象。1977年,Halstead等通過體外實(shí)驗(yàn)證明了登革病毒的ADE現(xiàn)象,同時(shí)將恒河猴用稀釋的人抗登革4型血清免疫后再次感染登革2型病毒,發(fā)現(xiàn)免疫組動(dòng)物血清中的病毒滴度是未免疫組的50倍。恒河幼猴用稀釋的黑猩猩抗登革病毒抗體免疫后使其感染登革4型病毒,免疫組在感染5～6d后血清中病毒滴度達(dá)到峰值,是未免疫組的100倍,與臨床登革出血熱患者的病癥一致。Balsitis等發(fā)現(xiàn)高劑量抗體免疫AG129小鼠后感染登革病毒后病毒血癥消失,低劑量抗體免疫小鼠后有ADE現(xiàn)象產(chǎn)生,并首次建立了登革病毒ADE研究的小動(dòng)物模型。研究發(fā)現(xiàn),ADE不僅存在于黃病毒中,在人免疫缺陷病毒、腸道病毒71型、埃博拉病毒、流感病毒等冠狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)中也存在。這些病毒的共性包括可在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖、能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量針對同源病毒的次中和抗體,引發(fā)持續(xù)感染并有持久的病毒血癥等。1病毒對抗機(jī)制1.1關(guān)于fc-fcp的檢測1981年P(guān)eiris等通過西尼羅病毒首次探討了ADE的FcR途徑,即病毒初次感染時(shí)機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體在較低濃度水平就可以有效介導(dǎo)再次感染時(shí)病毒與免疫細(xì)胞的融合形成的免疫復(fù)合物,通過抗體Fc段與靶細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合,增強(qiáng)細(xì)胞對病毒的攝入,導(dǎo)致感染增強(qiáng)。Brown等將靶細(xì)胞表面的Fc受體用單抗封閉,觀察到在病毒-抗體復(fù)合物存在下檢測到病毒滴度比未封閉前明顯降低。不同型別的Fc受體對ADE作用也有選擇性,FcγRⅡ比FcRⅠ更容易介導(dǎo)ADE,FcRⅡa能夠介導(dǎo)成熟樹突狀細(xì)胞的ADE,而FcRⅡb無此作用。用單抗封閉細(xì)胞的FcγRⅡa后ADE現(xiàn)象消失,單抗的F(ab)2段也不顯示ADE作用。目前普遍認(rèn)為IgG抗體介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞表面FcR的結(jié)合。Balsitis等對登革病毒單克隆抗體IgG1的297位谷氨酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,使抗體失去Fc結(jié)合活性,發(fā)現(xiàn)改造后的抗體喪失了登革2型病毒的感染增強(qiáng)能力。Halstead等從猴抗登革血清中分離出IgG和IgM抗體,發(fā)現(xiàn)只有IgG能介導(dǎo)ADE,而IgM對病毒完全中和。切除單克隆抗體IgGN端Fc受體結(jié)合位點(diǎn)處的9個(gè)氨基酸(第231～239位氨基酸),可使ADE現(xiàn)象消失而不影響抗體的體外中和活性[4。登革2型和4型病毒E蛋白的IgG1、IgG2a和IgG2b單克隆抗體也能增強(qiáng)登革病毒對FcR+細(xì)胞的感染作用,而其他亞型抗體(IgA、IgD、IgE)對ADE的影響尚未見報(bào)道。1.2其他補(bǔ)體受壓病1983年Cardosa等發(fā)現(xiàn)西尼羅病毒在FCR+細(xì)胞中產(chǎn)生的ADE可以被CR3的單抗封閉,但不可以被FcR的單抗封閉。在病毒-抗體復(fù)合物中,抗體的Fc段同補(bǔ)體C1結(jié)合,啟動(dòng)經(jīng)典途徑激活C3,C3可以共價(jià)結(jié)合到抗體或病毒表面,同時(shí)識(shí)別細(xì)胞表面補(bǔ)體受體,形成病毒-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物,在病毒和靶細(xì)胞間起到了橋梁作用,促進(jìn)病毒內(nèi)化和感染增強(qiáng)。關(guān)于ADE的補(bǔ)體途徑還有另外兩種假說:一是補(bǔ)體C1q結(jié)合病毒表面蛋白識(shí)別細(xì)胞表面C1q受體,促進(jìn)病毒同細(xì)胞的結(jié)合;二是通過CR作用增加病毒與靶細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合概率。登革病毒特異的IgG亞群對登革出血熱的發(fā)病起重要的作用。在登革出血熱患者體內(nèi)存在高水平的登革特異性IgG1、IgG4和低水平的IgG2;當(dāng)與抗原結(jié)合后,不同IgG亞型以不同的形式激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑。激活的補(bǔ)體可增加血管滲透性.導(dǎo)致凝血功能的異常[11。由于FCR只存在于免疫系統(tǒng)相關(guān)細(xì)胞表面,而CR則更廣泛存在于不同的細(xì)胞系,因此CR途徑有利于解釋廣泛條件下存在的ADE現(xiàn)象。1.3prm抗體主要通過非fcr作用當(dāng)形成病毒-抗體復(fù)合物后,抗體同細(xì)胞表面相關(guān)分子相互作用,引發(fā)病毒包膜蛋白的構(gòu)象改變,增強(qiáng)病毒和靶細(xì)胞的膜融合作用引發(fā)ADE。該過程不受細(xì)胞表面受體特異性的影響。一般認(rèn)為,中和抗體有助于病毒通過FcR感染細(xì)胞。PrM的抗體能同時(shí)特異性地識(shí)別病毒prM和細(xì)胞自身抗原,有效提高登革病毒結(jié)合FcR+細(xì)胞的能力,激發(fā)感染增強(qiáng)。prM抗體也能增強(qiáng)登革病毒對FcR-細(xì)胞的感染能力,在感染增強(qiáng)患者的血清中分離得到PrM抗體,證明了增強(qiáng)抗體通過非FcR作用也能誘發(fā)登革病毒的ADE現(xiàn)象[12。β2-微球蛋白、CD15和CD33等非FcR結(jié)合分子對登革病毒也有感染增強(qiáng)作用。ADE的強(qiáng)度與DC-SIGN的表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)。成熟的樹突狀細(xì)胞在表達(dá)FcγRⅡa的同時(shí)低表達(dá)DC-SIGN,呈現(xiàn)明顯的ADE現(xiàn)象,而未成熟的樹突狀細(xì)胞的DC-SIGN表達(dá)量是成熟樹突狀細(xì)胞的2倍,卻不顯示ADE。將未成熟的樹突狀細(xì)胞降低DC-SIGN和提高FcγRⅡa的表達(dá)后可檢測到ADE存在,提示了登革病毒入侵樹突狀細(xì)胞途徑的多樣性(DC-SIGN或FcγRⅡa途徑)。在適當(dāng)濃度的DC-SIGN環(huán)境下,病毒優(yōu)先通過DC-SIGN作用增強(qiáng)感染,而在高濃度的DC-SIGN環(huán)境下FcR不發(fā)揮ADE介導(dǎo)作用,類似現(xiàn)象在其他黃病毒中也有報(bào)道。同時(shí),不同的入侵途徑還影響到細(xì)胞感染強(qiáng)度、病毒產(chǎn)量以及細(xì)胞因子等因素。2影響因素：突變病毒ade2.1fcr+細(xì)胞ADE作用的靶細(xì)胞多為成熟的單核/巨噬細(xì)胞系,其他如抗原呈遞細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和其他粒細(xì)胞等FcR+細(xì)胞在一定條件下也能成為ADE的靶細(xì)胞[13。同時(shí),病毒感染中的ADE強(qiáng)度還與靶細(xì)胞種類、分化成熟及活化程度有關(guān)。2.2ade通過抗體檢測ADE過程中的增強(qiáng)性抗體主要由二次感染異型登革病毒的患者產(chǎn)生或由嬰兒從母體獲得,可以是中和抗體、非中和抗體和交叉反應(yīng)抗體。4個(gè)血清型的登革病毒在抗原上是密切相關(guān)的,初次感染登革病毒的患者血清中能產(chǎn)生大量中和抗體,這些抗體對同型病毒的中和作用可以持續(xù)數(shù)年,而針對異型病毒的中和作用只能持續(xù)3～4個(gè)月[14。當(dāng)再次感染異型病毒時(shí),這些低濃度的亞中和抗體與非中和抗體不再發(fā)生中和,而是通過ADE復(fù)合物的產(chǎn)生與受體結(jié)合,成為增強(qiáng)型抗體誘發(fā)感染增強(qiáng)。在病毒感染過程中,ADE現(xiàn)象的發(fā)生還與病毒感染和被動(dòng)免疫的間隔時(shí)間有關(guān)。在病毒感染宿主的同時(shí)接種特異性抗體,該抗體可起到有效的保護(hù)作用,而在病毒感染后再接種抗體,該抗體則可能增強(qiáng)病毒感染。2.3e蛋白和prm蛋白登革病毒基因組編3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白,結(jié)構(gòu)蛋白包括衣殼蛋白(C),以二聚體或三聚體的結(jié)構(gòu)存在的包膜糖蛋白(E),以及以1∶1的形式同E蛋白Ⅱ域結(jié)合的內(nèi)膜蛋白(prM)。prM存在一個(gè)弗林蛋白酶(furin)切割位點(diǎn),在高爾基體內(nèi)被切割為信號(hào)肽(pr)和成熟的跨膜蛋白(M)。目前ADE的相關(guān)研究集中于E蛋白和prM蛋白。E蛋白Ⅱ域的鼠源單克隆抗體能增強(qiáng)登革2型病毒對K562細(xì)胞的感染,Zheng等[15將E蛋白H244位的組氨酸替換為丙氨酸,弱化了信號(hào)肽與E蛋白的結(jié)合,發(fā)現(xiàn)ADE現(xiàn)象消失。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明,H244位的改變不影響病毒結(jié)構(gòu)蛋白的合成但能抑制病毒的包裝和釋放。在對不同濃度登革病毒的E蛋白單抗和prM單抗對比中發(fā)現(xiàn),E蛋白單抗具有明顯的中和作用,而prM單抗顯示較強(qiáng)的ADE作用,中和作用不明顯[16。Zybert等[17將完全不成熟的病毒經(jīng)prM53～67區(qū)段的單抗和prM單抗2h2分別處理,發(fā)現(xiàn)病毒感染性顯著增強(qiáng)。同時(shí),構(gòu)建弗林酶切位點(diǎn)90位賴氨酸缺失的登革病毒,發(fā)現(xiàn)ADE消失,這表明E蛋白、prM蛋白以及病毒的成熟在ADE過程中均發(fā)揮重要作用。2.4成分血熱及登革型的表達(dá)病毒同靶細(xì)胞的結(jié)合不一定誘發(fā)ADE。在病毒-抗體復(fù)合物內(nèi)化的過程中,還涉及病毒和靶細(xì)胞的其他細(xì)胞過程,改變了靶細(xì)胞正常的免疫功能。Chen等對比登革出血熱和登革熱休克綜合征患者的臨床數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn),在無異型血清存在時(shí),登革Ⅱ型病毒感染機(jī)體后能產(chǎn)生大量的γ干擾素,而有異型血清存在時(shí),γ干擾素、Th1表達(dá)下調(diào),白介素-4、前列腺素E2、白介素-10表達(dá)上調(diào)。在登革熱患者血清中,成熟樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的ADE能增強(qiáng)炎癥因子的釋放,僅在感染增強(qiáng)水平上可以檢測到腫瘤壞死因子α、白介素-6、γ干擾素,提示這些分子可以作為ADE發(fā)生的信號(hào)物質(zhì)。3ade對綠毒試驗(yàn)的發(fā)展3.1登革病毒ade研究登革病毒ADE受多種因素影響,包括病毒株、感染量、宿主細(xì)胞表面受體和抗體結(jié)合活性、抗體濃度、抗體亞型以及細(xì)胞因子等諸多方面,探討核心因素并加以改造消除,是當(dāng)前ADE的研究重點(diǎn)。登革病毒ADE研究的最大的挑戰(zhàn)在于缺少合適的動(dòng)物模型。人、低等靈長類動(dòng)物及蚊是登革病毒的自然宿主,但只有人被登革病毒感染后出現(xiàn)臨床癥狀。WHO推薦用靈長類動(dòng)物來評價(jià)減毒黃熱病疫苗的向神經(jīng)性和趨內(nèi)臟性,但是靈長類動(dòng)物感染后僅能出現(xiàn)短暫性的病毒血癥,所以只能通過檢測病毒血癥來間接評估。盡管乳小鼠經(jīng)腦內(nèi)接種可產(chǎn)生腦炎癥狀,嚴(yán)重時(shí)致死亡,但乳小鼠感染后的發(fā)病過程與人有所不同。而在體外實(shí)驗(yàn)中有中和作用的低劑量抗體被動(dòng)免疫小鼠時(shí)卻有ADE現(xiàn)象產(chǎn)生,提示體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的差異性。目前常用干擾素受體缺陷的AG129小鼠作為動(dòng)物模型。3.2結(jié)構(gòu)蛋白基因和prm的不良反應(yīng)登革病毒的ADE現(xiàn)象為相關(guān)疫苗的研發(fā)帶來了新的挑戰(zhàn)和提示。登革病毒包括4個(gè)血清型,且二次感染時(shí)亞中和水平的抗體可導(dǎo)致患者病情加重,因此,理想的登革疫苗應(yīng)能誘導(dǎo)人體產(chǎn)生針對4型登革病毒穩(wěn)定的終生