可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽mrnas在慢性嗎啡依賴大鼠下丘腦中表達(dá)的變化

可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽mrnas在慢性嗎啡依賴大鼠下丘腦中表達(dá)的變化

可卡因-苯丙胺誘導(dǎo)劑（kamin-regraham，脾臟，肝臟）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與食物行為相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)。其mrnas在可卡因和苯丙胺鈉的急性注射中得到了調(diào)整。最近的研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)物中樞給予CART后表現(xiàn)出與給予依賴劑量可卡因一樣的運(yùn)動(dòng)興奮性增加,并促進(jìn)位置偏愛的形成。下丘腦是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分之一,它也是許多與阿片耐受和依賴有密切關(guān)系的肽能神經(jīng)元的集中地。CARTmRNAs在與阿片依賴密切相關(guān)的腦區(qū)如伏膈核、腹側(cè)被蓋區(qū)和下丘腦的視上核(SON)、室旁核(PVN)、弓形核(Arc)、室周核(PeV)等核團(tuán)有豐富的表達(dá),這提示CART可能與精神藥物的依賴性有關(guān)。慢性嗎啡處理不僅導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)明顯的軀體依賴,而且在嗎啡依賴形成過(guò)程中出現(xiàn)進(jìn)食行為減少,體重減輕等現(xiàn)象;而中樞CART的增加可明顯抑制動(dòng)物的進(jìn)食行為,從而導(dǎo)致動(dòng)物的體重降低。因此有理由推測(cè)嗎啡處理可能會(huì)導(dǎo)致中樞CARTmRNAs在大鼠下丘腦中的表達(dá)發(fā)生改變?yōu)樽C實(shí)這些推測(cè)我們采用原位雜交方法來(lái)觀察慢性嗎啡處理和戒斷期間大鼠下丘腦中CARTmRNAs表達(dá)的變化。1材料和方法1.1分組、治療方法成年SD大鼠20只,♂,體重160-170g,第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物所提供。隨機(jī)分為4組(正常組,嗎啡依賴組,正常+納洛酮組,嗎啡依賴+納洛酮組),每組5只,控制室溫為20℃±s2℃,濕度為40%±s5%,自由進(jìn)食和飲水,保持光照節(jié)律(7:00-19:00照明)。1.2納洛酮促進(jìn)劑用量根據(jù)RasmussenK的方法建立嗎啡依賴模型,動(dòng)物d1晚腹腔注射(ip)嗎啡5mg·kg-1,d2早上和中午各ip5mg·kg-1,晚上劑量增加到10mg·kg-1,d3早上和中午各ip10mg·kg-1,晚上ip20mg·kg-1;從d4開始,在前一天給藥劑量的基礎(chǔ)上每天每次增加10mg·kg-1,至d7每次劑量為50mg·kg-1(兩次),晚上停藥,24h后,進(jìn)行納洛酮催促試驗(yàn),納洛酮?jiǎng)┝繛?0mg·kg-1(ip)。對(duì)照組大鼠ip生理鹽水。1.3逆轉(zhuǎn)錄so-soct鹽酸嗎啡,青海制藥廠出品[青衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第0113號(hào)]。鹽酸納洛酮(N7758),美國(guó)Sima公司出品,批號(hào):51418-60-8;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(OmniscriptRTKits),小量質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒,德國(guó)QIAGEN公司。預(yù)混的DNA聚合酶[PremixTaq(EXTMTaq)Kit],PCR產(chǎn)物克隆載體(pMDT載體),限制性內(nèi)切酶,日本TAKARA公司。1.4cartpsk酶切鑒定將CARTpMDT用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切,回收片斷亞克隆到克隆載體pBluescript(+)SK載體,經(jīng)酶切鑒定后,大量制備CARTPSK。取5μgCARTPSK分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切,使其完全線性化;膠回收Kit回收模板。分別用T7和T3RNA聚合酶合成地高辛標(biāo)記的正意和反意cRNA探針,-80℃保存?zhèn)溆?.5抗地高辛抗體t的制備將動(dòng)物麻醉,開胸灌流,用4%的多聚甲醛進(jìn)行內(nèi)固定,取出腦組織,在同樣的固定液中固定12h以上,入30%的蔗糖至組織完全沉下。取出組織在0.1mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗10min,進(jìn)行冰凍切片,片厚30μm,切片入多聚甲醛后固定6h以上,取出在PBS中漂洗數(shù)次,用蛋白酶K(1μg·ml-1)在37℃下消化20min后,室溫下浸入0.1mol·L-1甘氨酸緩沖液中10min,用4%的多聚甲醛固定5min。在PBS中漂洗數(shù)次后,切片加入含0.25%醋酸酐的0.1mol·L-1三乙醇胺中孵育10min,漂洗后切片在含500ng·ml-1CART探針的雜交液中42℃過(guò)夜。雜交后切片用2×SSC在室溫下洗2次,然后分別用2×SSC和0.1×SSC在42℃中各洗2次共約30min,接著在緩沖液Ⅰ[0.1mol·L-1三羥甲基氨基甲烷(Tris),pH=7.5,0.15mol·L-1氯化鈉(NaCl)]中孵育10min后,加入用緩沖液Ⅱ[(Buffer)I+2%牛血清白蛋白(BSA)]配制的抗地高辛抗體(Boehringer,1:1000)溶液中37℃孵育2h。孵育后,切片用緩沖液Ⅰ洗數(shù)次,入緩沖液Ⅲ[100mmol·L-1Tris,pH=9.5,100mmol·L-1NaCl,50mmol·L-1氯化鎂(MgCl2)]中平衡10min后,室溫下顯色3-6h,用TE[10mmol·L-1Tris.HCl,1mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)]中止顯色反應(yīng)。將切片貼在經(jīng)硅烷化處理的載玻片上,37℃干燥過(guò)夜。常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。正義探針和核糖核酸酶處理對(duì)照同批進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.6張數(shù)和視上核根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜,在前囟后0-2mm(B0～-2.0)之間隨機(jī)選擇15張包含視上核或室旁核的切片,用全自動(dòng)圖像分析軟件記錄視上核和室旁核的陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目;同時(shí)進(jìn)行灰度測(cè)定,分別選定視上核和室旁核,去除背景后,記錄相對(duì)灰度作為統(tǒng)計(jì)值。所有數(shù)據(jù)用表示,應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)和組間t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1兩組大鼠血清中cartmrnas的視子轉(zhuǎn)化在大鼠下丘腦,CARTmRNA陽(yáng)性神經(jīng)元集中在視上核和室旁核(圖2、3),其他核團(tuán)未見明顯的表達(dá),正義探針和核糖核酸酶A(RNaseA)處理組未見任何陽(yáng)性信號(hào)慢性嗎啡處理后,CARTmRNAs在視上核的表達(dá)增多(圖2)。正常組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目為44.2±s14.3,嗎啡依賴組63.8±s18.2,比正常組增加了44.3%(圖4A,P<0.001)。嗎啡依賴+納洛酮組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)為47.6±s12.2,比嗎啡依賴組減少了34.0%(P<0.01),但與正常+納洛酮組相比無(wú)明顯差異。各組間相對(duì)灰度的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)。2.2u3000不同藥物對(duì)0.55.55.55.75.55.55.55.555.55.55.55.55.55.555.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.555.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55.55室旁核中CARTmRNAs的表達(dá)在慢性嗎啡處理后也增加(圖3),正常組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為85.3±s34.6,嗎啡依賴組為118.5±s55.0,比正常組增加了38.9%(圖4A,P<0.05)。嗎啡依賴+納洛酮組陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)為74.7±s10.1,比嗎啡依賴組減少了58.6%(P<0.05),但與正常+納洛酮組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組間相對(duì)灰度變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4B)。3慢性咯中神經(jīng)元/排他體cart的結(jié)構(gòu)及對(duì)行為的影響CART是一種新近發(fā)現(xiàn)的、與動(dòng)物的進(jìn)食行為密切相關(guān)的肽或蛋白。有資料顯示CART在與阿片成癮相關(guān)的伏隔核、腹側(cè)被蓋區(qū)和下丘腦等腦區(qū)有明顯表達(dá)?？煽ㄒ?、苯丙胺等精神依賴性藥物可明顯促進(jìn)其在紋狀體的表達(dá),提示CART可能與藥物成癮有密切關(guān)系。本研究表明,慢性嗎啡處理可明顯促進(jìn)下丘腦視上核和室旁核CARTmRNA陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目,其陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較對(duì)照組分別增加44.3%和38.9%,表明嗎啡同其他精神刺激物一樣可促進(jìn)CART的表達(dá),提示CART可能參與阿片依賴的形成。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),盡管慢性嗎啡處理可增加下丘腦視上核和室旁核CARTmRNA陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量,但對(duì)其相對(duì)灰度無(wú)明顯影響。對(duì)這一結(jié)果的可能解釋是,慢性嗎啡處理可能使正常情況下不表達(dá)CART的神經(jīng)元,由于嗎啡的作用開始表達(dá)而單個(gè)神經(jīng)元表達(dá)的量并不受慢性嗎啡處理的影響。下丘腦SON和PVN的纖維投射廣泛,除下丘腦外,還投射到伏隔核,隔區(qū),蘭斑,腹側(cè)被蓋區(qū)等與嗎啡成癮關(guān)系密切的核團(tuán);由其大細(xì)胞性神經(jīng)元合成分泌的催產(chǎn)素(OT)能抑制嗎啡等阿片類物質(zhì)依賴和耐受的形成,而慢性嗎啡處理可抑制OT的合成與釋放。在SON和PVN的大細(xì)胞性神經(jīng)元和小細(xì)胞性神經(jīng)元中均有CART陽(yáng)性神經(jīng)元,其中OT神經(jīng)元中大量為CART陽(yáng)性神經(jīng)元。慢性嗎啡處理對(duì)視上核和室旁核CARTmRNA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的影響不同于對(duì)催產(chǎn)素mRNA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的影響,這與中樞注射CART可使血漿中OT水平短暫升高的報(bào)道矛盾。由于血漿中OT主要與垂體的功能有關(guān),因此CART引起的血漿中OT的短暫升高可能是垂體的釋放增加所致。慢性嗎啡處理后,CART使腦和血漿中的OT水平發(fā)生怎樣的改變?這種變化是否與嗎啡對(duì)OT的影響一致?目前尚未清楚,還有待進(jìn)一步研究。阿片依賴形成過(guò)程中體重的降低與動(dòng)物進(jìn)食減少有密切關(guān)系。下丘腦是調(diào)節(jié)進(jìn)食行為的神經(jīng)中樞。刺激下丘腦外側(cè)部可促進(jìn)動(dòng)物大量進(jìn)食,而刺激下丘腦腹內(nèi)側(cè)核,即使動(dòng)物當(dāng)時(shí)處于極端饑餓狀態(tài)下也會(huì)拒絕進(jìn)食上述腦區(qū)的毀損分別導(dǎo)致動(dòng)物進(jìn)食增加和減少,從而明顯影響動(dòng)物的體重。盡管CART的生理學(xué)功能的研究主要集中在對(duì)進(jìn)食行為的影響,我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中仍未觀察到腹內(nèi)側(cè)核和背內(nèi)側(cè)核CART的表達(dá),但不能排除腹內(nèi)側(cè)核和背內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元參與CART誘導(dǎo)的進(jìn)食行為的變化。由于目前還沒有CART受體的克隆和結(jié)合位點(diǎn)分布的報(bào)道,因此視上核和室旁核合成的CART是否通過(guò)作用于腹內(nèi)側(cè)核和背內(nèi)側(cè)核的神經(jīng)元影響進(jìn)食行為還不得而知。在嗎啡依賴過(guò)程中,中樞CART是否參與阿片依賴的形成,特別是參與依賴過(guò)程中進(jìn)食行為的減少,目前尚未見報(bào)道。在阿片依賴形成中,下丘腦視上核和室旁核CA