生物基因組序列比對分析

生物基因組序列比對分析，分子進(jìn)化兔肝DNA的提取與二苯胺顯色法測定DNA含量目的基因SNP位點(diǎn)的鑒定及其意義綜合性設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)-5WWW.Ggene.Cn此實(shí)驗(yàn)共包括如下三個(gè)局部第一局部：生物基因組序列比對分析，分子進(jìn)化第二局部：兔肝DNA的提取和測定第三局部：目的基因SNP位點(diǎn)的鑒定及其意義WWW.Ggene.Cn第一局部：生物基因組序列比對分析、分子進(jìn)化全基因組序列數(shù)據(jù)的積累,使得不同生物之間的進(jìn)化關(guān)系可以從分子水平上進(jìn)行研究。不同于以往單純依賴于生物形態(tài)學(xué)特征,這種分析更加深刻更加本質(zhì)。利用分子序列使得我們可以研究,從單細(xì)胞生物到植物、動(dòng)物甚至人的進(jìn)化關(guān)系。比較基因組學(xué)(ComparativeGenomics)是基于基因組圖譜和測序根底上，對的基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，來了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化的學(xué)科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機(jī)制，說明物種進(jìn)化關(guān)系，及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。目前從模式生物基因組研究中得出一些規(guī)律：模式生物基因組一般比較小，但編碼基因的比例較高，重復(fù)順序和非編碼順序較少；其GC%比較高；內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu)組織比較保守，剪切位點(diǎn)在多種生物中一致。WWW.Ggene.Cn比較作圖就是利用共同的遺傳標(biāo)記〔主要是分子標(biāo)記、基因的cDNA克隆以及基因組克隆〕對相關(guān)物種進(jìn)行物理或遺傳作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布情況，提示染色體或染色體片段上的同線性〔synteny〕或共線性〔collinearity〕，從而對不同物種的基因組結(jié)構(gòu)及基因組進(jìn)化歷程進(jìn)行精確分析。基因組比較作圖的研究，不僅提示了同屬甚至同科物種基因組間的同源性和差異性，對不同物種在起源、演化過程中的變化的研究具有巨大的啟示作用。比較作圖的研究意義在于：一、根據(jù)不同種的基因組基因及其排列順序的高度保守特點(diǎn)繪制而成的比較圖，可以研究和探明它們的進(jìn)化線索。廣泛的比較作圖可為多個(gè)種所用，建立它們之間的聯(lián)系框架或系統(tǒng)。WWW.Ggene.Cn基因組比對軟件Mauve/vista/index.shtml

VISTAWWW.Ggene.Cn一個(gè)最根本的假設(shè)是地球上所有物種都有一個(gè)共同的祖先，從這個(gè)祖先開始以數(shù)狀形式開展，通常稱為生命之樹〔treeoflife〕。分子進(jìn)化研究的目的：通過序列同源性的比較，分析序列間的變化進(jìn)而了解基因的進(jìn)化以及生物系統(tǒng)發(fā)生的內(nèi)在規(guī)律。分子進(jìn)化有兩個(gè)主要研究對象，以全基因組序列為研究對象分析物種進(jìn)化；以某基因在多個(gè)物種的同源序列為研究對象分析基因的進(jìn)化分子進(jìn)化WWW.Ggene.Cn末端物種中間枝條根末端分支節(jié)點(diǎn)理論上，一個(gè)DNA序列在物種形成或基因復(fù)制時(shí)，分裂成兩個(gè)子序列，因此系統(tǒng)發(fā)育樹一般是二歧的；如果是一棵有根樹，那么樹根代表在進(jìn)化歷史上是最早的、并且與其它所有分類單元都有聯(lián)系的分類單元，反映時(shí)間順序；如果找不到可以作為樹根的單元，那么系統(tǒng)發(fā)生樹是無根樹，反映距離；從根節(jié)點(diǎn)出發(fā)到任何一個(gè)節(jié)點(diǎn)的路徑指明進(jìn)化時(shí)間或者進(jìn)化距離。系統(tǒng)發(fā)生樹性質(zhì)：WWW.Ggene.Cn基因分子進(jìn)化分析步驟〔1〕以目的基因?yàn)榉N子序列，搜索其在其它物種中的同源序列WWW.Ggene.Cn〔2〕將上述同源基因的核酸或蛋白序列作序列比對，ClustalXWWW.Ggene.Cn〔3〕構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹：MEGA，PHYLIP，PAUP

WWW.Ggene.Cn〔4〕評價(jià)所建立的樹，分析其生物學(xué)意義WWW.Ggene.Cn實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)從動(dòng)物組織中提取DNA及其含量、純度測定的原理和方法

掌握離心機(jī)及島津UV-120的使用方法第二局部：兔肝脫氧核糖核酸〔DNA〕的提取和測定WWW.Ggene.Cn利用脫氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在電解質(zhì)中不同的溶解度使二者別離，在0.15M的氯化鈉溶液中脫氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在0.15M氯化鈉中溶解，因此可利用不同濃度的氯化鈉溶液將核酸核蛋白、脫氧核糖核酸蛋白解離出來，而蛋白質(zhì)變性沉淀，再用氯仿－異丙醇抽提，將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA那么溶解。實(shí)驗(yàn)原理WWW.Ggene.Cn實(shí)驗(yàn)操作1.棄上清留沉淀兔肝稱取4g加8ml1XSSC1XSSC洗兩次取8ml勻漿液離心勻漿、過濾2.棄上清留沉淀加至8ml1XSSC離心加至8ml0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA離心3.棄上清留沉淀（脫氧核糖核蛋白）WWW.Ggene.Cn加約2倍體積95%乙醇沉淀加0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA至4ml攪拌10min逐滴加入0.5ml15%SDS加1ml5MNaCl去塞！離心加塞反復(fù)倒置抽提10min吸取上清液勿吸到中間層！等體積氯仿-異丙醇混合液DNA析出用玻棒挑出挑取DNA至一離心管(小燒杯)用10ml0.01NNaOH溶解重復(fù)一次輕攪10minWWW.Ggene.Cn本卷須知盡可能防止DNA的斷裂1.勻漿時(shí)應(yīng)保持低溫，且勻漿時(shí)間應(yīng)短；2.實(shí)驗(yàn)中使用的吸取DNA水溶液的滴管口應(yīng)粗短并成鈍口。保持DNA活性，防止酸堿或其他變性因素使DNA變性。攪動(dòng)不要太大，以免使DNA斷裂。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行。攪拌時(shí)動(dòng)作要輕，反復(fù)倒置抽提，不可劇烈振蕩。WWW.Ggene.Cn參加15%SDS時(shí)要慢，邊攪邊滴加〔兩人配合〕。SDS的溫度不能太低，易凝固。吸過SDS的吸管要及時(shí)清洗。參加CHCl3/IAA液離心后，分為三層，由上到下為：無機(jī)相-蛋白相-有機(jī)相。DNA溶解在無機(jī)相中，吸取無機(jī)相時(shí)動(dòng)作要輕，不要吸到蛋白相。CHCl3/IAA會(huì)溶解有機(jī)玻璃，用完后不能豎直放置在試管架上，必須沖洗干凈。WWW.Ggene.Cn離心機(jī)的使用翻開電源開關(guān)；平衡放置離心管；蓋上蓋子。調(diào)節(jié)時(shí)間旋鈕至10min；緩慢調(diào)節(jié)速度旋鈕至9檔，每5-10s上升1檔；離心完畢后機(jī)器自動(dòng)停止，待完全停止后，翻開蓋子取出離心管。離心管必須平衡后，才能啟動(dòng)離心機(jī)；離心機(jī)的蓋子必須蓋緊；離心過程中不要用重物撞擊離心機(jī)；要等離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)后再翻開蓋子。WWW.Ggene.Cn二苯胺顯色法測定DNA含量DNA的α-脫氧核糖在酸性條件下轉(zhuǎn)變成ω-羥基-r酮基戊醛，與二苯胺共熱后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處最大吸收。每ml含20－400μg范圍內(nèi)光密度與DNA的濃度成正比。反響液中參加少量乙醛，可提高反響的靈敏度。實(shí)驗(yàn)原理WWW.Ggene.Cn取8支試管，按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的表格參加試劑。加畢置沸水浴10分鐘，取出冷卻；以0號管〔空白管〕調(diào)零點(diǎn)，于595nm波長比色。以光密度為縱坐標(biāo)，DNA含量〔μg/ml〕為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將實(shí)驗(yàn)中所得到的兔肝DNA溶液作為待測樣品，取兩只試管，分別標(biāo)“U〞和“B〞，按表參加試劑。混勻，置沸水中10min,取出冷卻。在595nm處，以B管調(diào)零，測得待測液的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)于該光密度值DNA的含量。實(shí)驗(yàn)操作WWW.Ggene.Cn核酸在220-320nm處呈特征性吸收，在260nm處有最大吸收，測A260/A280可得知核酸的大致純度。A260/A280≈1.8表示DNA純>1.8RNA含量高<1.8蛋白含量高核酸紫外吸收光譜的測定WWW.Ggene.Cn雙波長分光光度計(jì)，該種機(jī)采用兩個(gè)光源，可在可見光和紫外區(qū)對物質(zhì)進(jìn)行分析，鎢絲燈發(fā)出光的適宜范圍在360－1000nm，氘燈發(fā)出光的適宜范圍在150－400nm。通過兩種光源的切換，可以在兩種波長范圍內(nèi)使用。使用石英杯作為比色杯。島津UV-120分光光度計(jì)WWW.Ggene.Cn翻開電源，指示燈亮，調(diào)至UV，翻開樣品室蓋翻開氘燈〔向下按至Heat幾秒后扳至ON〕預(yù)熱10min調(diào)節(jié)波長、靈敏度旋扭調(diào)至“0-100%T〞，放入空白管與樣品，調(diào)0%T蓋上蓋子，旋扭調(diào)至“ABS0-2〞，調(diào)0%A拉出樣品，讀數(shù)。開蓋，記錄。島津UV-120使用方法WWW.Ggene.Cn以0.01NNaOH為空白管，在260nm和280nm波長處測定樣品液的吸光度，求出樣品液的A260/A280比值和DNA濃度。實(shí)驗(yàn)操作WWW.Ggene.Cn第三局部：目的基因SNP位點(diǎn)的鑒定及其意義SNP(singlenucleotidepolymophism)即單核苷酸多態(tài)，是指群體中變異頻率大于1%的單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)，包括置換、顛換、缺失和插入。一般來說，一個(gè)SNP位點(diǎn)只有兩種等位基因，因此又叫雙等位基因。SNP在人基因組中的發(fā)生頻率比較高，大約平均每1000個(gè)堿基中就有一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)?！瑿CATTGAC...…GGTAACTG...…CCGTTGAC...…GGCAACTG...WWW.Ggene.CnSNP對基因功能影響根據(jù)在基因中的位置，SNP可分為基因編碼區(qū)SNP(codingSNP,cSNP)、基因內(nèi)含子區(qū)SNP和基因調(diào)控區(qū)SNP(regulatorySNP,rSNP)。其中cSNP根據(jù)是否改變編碼的氨基酸又可分為同義cSNP(synonymouscSNP)和非同義cSNP(non-synonymouscSNP)。非同義cSNP：，蛋白激酶PRKCH基因內(nèi)的一個(gè)非同義cSNP(1425G/A)，等位位點(diǎn)從G到A的改變可導(dǎo)致激酶的活力增強(qiáng)，進(jìn)而激活其信號通路，使患腦堵塞的風(fēng)險(xiǎn)增加。同義cSNP：多向性耐藥基因1(MDR1)第3435位的一個(gè)同義SNP(3435C/T)可改變MDR1基因產(chǎn)物的功能。這種機(jī)制不是通過改變mRNA及蛋白的產(chǎn)量水平，而是通過改變mRNA的構(gòu)象、蛋白的折疊及細(xì)胞定位，進(jìn)而影響基因功能的發(fā)揮。內(nèi)含子區(qū)SNP：葡萄糖激酶調(diào)節(jié)蛋白(GCKR)基因第16號內(nèi)含子中的一個(gè)SNP(rs780094,T/C)，相比C等位位點(diǎn)，含T等位位點(diǎn)時(shí)，個(gè)體表現(xiàn)為葡萄糖水平較低、胰島素耐受較少，患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)較低。調(diào)控區(qū)rSNP：IFN-γ基因啟動(dòng)子區(qū)含一個(gè)rSNP(-764G/C)，相比C等位位點(diǎn)，含G等位位點(diǎn)時(shí)，IFN-g基因啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合增強(qiáng)，啟動(dòng)子活力提高到2~3倍。WWW.Ggene.Cn目的基因SNP的查詢WWW.Ggene.Cn輸入基因名稱與物種名稱，如NGAL,homoWWW.Gg