大鼠丘腦束旁核神經(jīng)元

大鼠丘腦束旁核神經(jīng)元

心悸是缺血性心臟病（ihs）的一個(gè)重要臨床癥狀。由于心肌缺血引發(fā)的心絞痛(癥狀)和急性心肌梗死(損傷)的程度往往不相平行,且目前對(duì)心絞痛的研究多是從急性心肌缺血時(shí)疼痛產(chǎn)生和傳導(dǎo)機(jī)制方面入手的,對(duì)于疼痛本身在急性心肌缺血時(shí)心肌損傷病理生理進(jìn)程中的作用和地位的研究尚有限。阿片受體是介導(dǎo)內(nèi)源性阿片肽及阿片類藥物作用的受體,其中μ1-阿片受體(μ1-opioidreceptor)亞型在痛覺調(diào)制中起重要作用。丘腦束旁核(parafascicularnucleus,Pf)是內(nèi)臟痛覺重要的整合中樞,具有廣泛的神經(jīng)纖維聯(lián)系,其內(nèi)含有豐富的阿片能神經(jīng)末梢及其受體。以往對(duì)Pf的研究多采用神經(jīng)電生理的方法,用原位雜交的方法來研究心肌缺血不同時(shí)點(diǎn)大鼠Pf神經(jīng)元μ1-阿片受體mRNA表達(dá)的變化鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在采用原位雜交技術(shù)來研究急性心肌缺血時(shí)大鼠Pf神經(jīng)元μ1-阿片受體mRNA表達(dá)的變化,以探討在急性心肌缺血傷害性刺激作用下,大鼠Pf中μ1-阿片受體在痛覺調(diào)制中所起的作用及機(jī)制。材料和方法1.冠狀動(dòng)脈前降支的制備采用健康成年雄性SD大鼠36只(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重260～280g。隨機(jī)平均分為兩組:對(duì)照組(non-coronaryarteryocclusion,C組)、扎閉冠脈(coronaryarteryocclusion,CAO)組。每組又分為1h、3h和6h三個(gè)不同時(shí)點(diǎn)的亞組。將動(dòng)物麻醉(25%烏拉坦1.2g·kg-1,i.p.)后行氣管切開,控制呼吸(RR75次/min,VT8ml·kg-1)。在左胸骨旁第4～5肋間作1cm長(zhǎng)切口,暴露心臟,剪開心包膜后用7～0無損傷縫線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(對(duì)照組動(dòng)物僅在冠狀動(dòng)脈下穿線,不結(jié)扎),并計(jì)時(shí)。然后逐層關(guān)胸,行胸腔負(fù)壓引流后,解除人工通氣,動(dòng)物恢復(fù)自主呼吸。術(shù)中每小時(shí)經(jīng)尾靜脈補(bǔ)給林格式液1ml。所有手術(shù)切口均用0.125%布比卡因施以局部麻醉,總量不超過1ml。2.腦塊沉底、固定開胸經(jīng)主動(dòng)脈根部灌注4℃4%多聚甲醛固定液300ml,取腦,把含有Pf的腦塊置于前述固定液中后固定10min;然后入4℃30%蔗糖(0.1mol/LPBS配置)中過夜至腦塊沉底。然后用恒冷箱切片機(jī)(LeicaCM-1850,德國(guó)Leica公司)行15μm厚冠狀冰凍連續(xù)切片,室溫下空氣中風(fēng)干,-70℃保存。3.u3000試劑雜交前,室溫平衡,孵育在2×SSC5min×2;切片入新鮮配制的0.3%H2O2的甲醇溶液中滅活內(nèi)源性的過氧化物酶,室溫下30min,雙蒸水洗滌3次;切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶以暴露mRNA核酸片段,37℃120秒鐘,原位雜交用PBS(0.5MPBS)沖洗5min×3,雙蒸水洗1次;每張切片滴加20μl預(yù)雜交液,恒溫箱內(nèi)孵育3小時(shí),吸去多余液體,不洗;每張切片滴加20μl雜交液,加蓋原位雜交專用蓋玻片,37℃恒溫箱內(nèi)雜交12h,揭掉蓋玻片,2×SSC洗滌5min×2,0.5×SSC洗滌15min×1,0.2×SSC洗滌15min×1;滴加封閉液,37℃30min,吸去多余液體,不洗;滴加生物素化鼠抗地高辛37℃60min,0.5MPBS沖洗5min×4;滴加SABC,37℃20min,0.5MPBS沖洗5min×3;滴加生物素化過氧化物酶,37℃20min,0.5MPBS沖洗5min×4;DAB顯色,鏡下適時(shí)終止,蘇木素復(fù)染,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性塑膠封片。每一組均設(shè)立試劑(陰性)對(duì)照(未使用μ1-阿片受體mRNA抗體)。μ1-阿片受體mRNA原位雜交檢測(cè)試劑盒、原位雜交專用蓋玻片、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司,DEPC購(gòu)自Sigma公司。4.小鼠骨髓1-阿片受體mrna的半定量分析用BX51-型Olympus光學(xué)顯微鏡高倍鏡下(×400)結(jié)合IDA-2000數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)(中科院北京空海科技發(fā)展有限公司)對(duì)Pf部位μ1-阿片受體mRNA染色陽性的細(xì)胞進(jìn)行半定量分析,分析指標(biāo)選用平均光度、積分光度、陽性面積和陽性單位。每張切片隨機(jī)分析Pf部位的七個(gè)視野。5.雙因素方差分析所有數(shù)據(jù)均用Xˉˉˉ±SXˉ±S表示,采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件包行雙因素方差分析,進(jìn)行同一時(shí)點(diǎn)不同組間和同一組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)的兩兩比較。如果方差齊,采用LSD法;如果方差不齊,則采用Games-Howell法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,P<0.05認(rèn)為差異有顯著性。心肌缺血引發(fā)的心臟傷害性刺激信號(hào)--丘腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)束的表達(dá)原位雜交結(jié)果:組織切片背底清晰,對(duì)照組各組中有染色陽性神經(jīng)元無規(guī)律地零星、散在分布,胞漿不著色或輕度著色,胞核淺淡,神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則,略顯模糊,細(xì)胞突起少。而CAO組大鼠Pf部位(圖1)μ1-阿片受體mRNA染色陽性神經(jīng)元顯著增加,呈不對(duì)稱散在分布,神經(jīng)元形態(tài)多樣,輪廓清晰,細(xì)胞突起較多,胞漿呈棕黃色,胞核不著色或輕度著色(圖2A、2B)。扎閉冠脈1h、3h、6h后Pf部位棕黃色陽性表達(dá)顆粒逐漸增多,而對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)比較則差異不明顯。統(tǒng)計(jì)結(jié)果:上述指標(biāo)在分組因素和時(shí)點(diǎn)因素間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且分組和時(shí)點(diǎn)具有交互作用。同一時(shí)點(diǎn)不同組間和同一組內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)兩兩比較結(jié)果顯示:在各相應(yīng)時(shí)點(diǎn)(1h、3h和6h),CAO與對(duì)照組相比均有顯著性差異(P<0.05);在同一組內(nèi)(CAO和對(duì)照組),CAO后的各時(shí)點(diǎn)之間比較差異均有顯著性(P<0.05),而對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)間比較差異無顯著性(P>0.05)。CAO后大鼠Pf神經(jīng)元μ1-阿片受體mRNA表達(dá)顯著增加,且隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)有逐漸增加的趨勢(shì)(見圖3)。疼痛是一種復(fù)雜的生理、心理活動(dòng),它往往與自主神經(jīng)活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)反射、心理和情緒反應(yīng)交織在一起,它不是簡(jiǎn)單地與軀體某一部分的變化有關(guān),也不是由神經(jīng)系統(tǒng)某個(gè)單一的傳導(dǎo)束、神經(jīng)核團(tuán)和神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行傳遞,疼痛刺激信號(hào)的產(chǎn)生、傳導(dǎo)和感受始終伴隨著復(fù)雜的神經(jīng)活動(dòng),并且始終處于機(jī)體自身的調(diào)制之中。心肌缺血引發(fā)的心臟傷害性刺激信號(hào)的傳導(dǎo)主要始于各種化學(xué)介質(zhì)對(duì)心臟化學(xué)感受器的共同致敏,機(jī)械刺激也有可能在激活冠狀動(dòng)脈傷害性感受器的過程中發(fā)揮一定的作用。傷害性沖動(dòng)通過交感神經(jīng)脊髓背角和脊髓丘腦束到達(dá)側(cè)部丘腦的腹后外側(cè)核和中部丘腦的中央外側(cè)核和中央中核-丘腦束旁核復(fù)合體,迷走神經(jīng)也從孤束核發(fā)出最終到達(dá)丘腦后腹核,發(fā)揮一定的作用。PET研究發(fā)現(xiàn),心肌缺血患者的腦血流量在雙側(cè)下丘腦明顯增多,并且當(dāng)心絞痛與缺血的心電圖變化消失時(shí),丘腦的活動(dòng)仍然持續(xù),與心肌缺血后持續(xù)性代謝紊亂相一致。人類的研究也說明心絞痛能夠興奮丘腦的核團(tuán),這提示丘腦是心絞痛產(chǎn)生的重要中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)。丘腦束旁核(Pf)屬于丘腦髓板內(nèi)核群,它接受脊-網(wǎng)-丘腦束的大量投射,不僅對(duì)內(nèi)臟傷害性刺激發(fā)生反應(yīng),而且是內(nèi)臟和軀體傷害性刺激的共同整合中樞,其內(nèi)含有豐富的阿片能神經(jīng)末梢及其受體。阿片受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體,包括μ、κ、δ、ζ、ε等多種亞型,其廣泛作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。μ-阿片受體又分為μ1、μ2等七種亞型,其中μ1-亞型與嗎啡的鎮(zhèn)痛作用有關(guān),其在痛覺調(diào)制中起主要作用。研究發(fā)現(xiàn),敲除μ基因的小鼠,給予嗎啡不能發(fā)揮抗傷害的功效。μ阿片受體主要分布于丘腦、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)、黑質(zhì)以及脊髓等腦內(nèi)與痛覺感受和鎮(zhèn)痛有關(guān)的腦區(qū),其中PAG是μ-受體介導(dǎo)阿片抑制疼痛下行神經(jīng)傳導(dǎo)通路的主要解剖位點(diǎn)。Northern印跡法表明大鼠μ-受體mRNA在中腦和下丘腦表達(dá)最多,并且在丘腦,μ-阿片受體mRNA和μ-受體的分布相當(dāng)一致。在脊髓及脊髓以上部位注射μ-阿片受體激動(dòng)劑可引起對(duì)各種實(shí)驗(yàn)性疼痛的鎮(zhèn)痛作用。放射受體自顯影研究表明,針刺能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)與鎮(zhèn)痛有關(guān)腦區(qū)的μ-阿片受體產(chǎn)生上行性調(diào)節(jié)作用,5-HT釋放劑芬氟明可使之進(jìn)一步增加。研究表明,阿片受體是功能性的,外周炎癥刺激能誘導(dǎo)中樞和外周神經(jīng)末梢μ-阿片受體上調(diào),福爾馬林致痛提高大鼠尾核頭部、杏仁核、中央灰質(zhì)、脊髓背角等腦區(qū)的μ-阿片受體密度;另一方面,激活各種類型的阿片受體,包括μ-阿片受體,能夠減輕大鼠后爪注射弗氏佐劑所引起的炎性疼痛。以上研究均表明傷害性刺激可以激活體內(nèi)的阿片肽能活性,導(dǎo)致阿片受體合成增加,從而減弱機(jī)體對(duì)傷害性感受的易化作用,維持機(jī)體自身的平衡。反之,脊髓背角表層抑制性神經(jīng)元凋亡,阿片μ-受體下降將明顯有利于傷害感受信號(hào)的傳遞。本實(shí)驗(yàn)中觀察到CAO后