中國(guó)人leber遺傳病線粒體dna3個(gè)原發(fā)致病基因突變位點(diǎn)的譜分析

中國(guó)人leber遺傳病線粒體dna3個(gè)原發(fā)致病基因突變位點(diǎn)的譜分析

遺傳因素的leber性神經(jīng)病變（lhon）是母系遺傳因素引起的盲性神經(jīng)疾病，其特點(diǎn)是青少年急性和亞急性中央視覺(jué)障礙。該病是由線粒體DNA(mtDNA)突變所致,至今已報(bào)道的相關(guān)mtDNA突變有近20種,其中90%～97%的LHON由G11778A、G3460A或T14484C3個(gè)原發(fā)致病突變中的一個(gè)所致。不同種族各種原發(fā)致病突變位點(diǎn)分布情況不同,白種人中90%以上的LHON患者有G3460A、G11778A、T14484C位點(diǎn)中的一種突變,歐洲患者的這3種突變率分別占15%～25%、50%～70%、15%[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13];亞洲人群LHON家系中G11778A位點(diǎn)突變率很高,占90%以上;中國(guó)人群中LHON患者的G3460A、T14484C點(diǎn)突變率還未被確定。為了了解中國(guó)人LHON患者的突變頻譜,我們檢查了140例無(wú)血緣關(guān)系的LHON患者先證者的G3460A、G11778A、T14484CmtDNA位點(diǎn)突變的分布情況,以確定中國(guó)人LHON患者原發(fā)致病突變頻譜。1對(duì)象和方法1.1病例選擇選擇原因一般在性別間不同140個(gè)LHON家系的先證者選自中山眼科中心1996～2002年門診與住院患者及外院送檢的病例。其中57例有LHON家族史,占40.7%;另83例為散發(fā)病例,占59.3%。140例LHON患者中,120例為男性,占85.7%;20例為女性,占14.3%?；颊甙l(fā)病年齡為7～40歲,平均年齡19.3歲。由于目前沒(méi)有明確的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),因此以基因診斷確診。眼科檢查:無(wú)痛性、急性或亞急性雙眼視力相繼下降,初診時(shí)最佳矯正視力為光感～0.6。所有患者均有視神經(jīng)異常,急性或亞急性視神經(jīng)炎和視神經(jīng)萎縮,排除其它原因引起的視神經(jīng)病變。未見(jiàn)其它神經(jīng)系統(tǒng)和心臟異常。詳細(xì)詢問(wèn)家族史,確定患者母系血緣親屬及其LHON患者。征得知情同意后抽取先證者和母系血緣親屬外周靜脈血。對(duì)照組20人來(lái)自視力及眼部檢查正常的人群,其中男性13人,女性7人,年齡17～29歲,平均年齡20.6歲。1.2方法1.2.1pcp和taqcda聚合酶用常規(guī)酚氯仿方法,從患者和正常人外周血中提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積為50μl,每種dNTP終濃度為200μmol/L、每對(duì)引物終濃度為0.25μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U(日本TaKaRa公司產(chǎn)品),95℃預(yù)變性5min。94℃變性45s,55℃退火60s,72℃延伸1min30s,循環(huán)30次,最后72℃延伸5min。檢測(cè)3種突變的引物(表1)。1.2.2瓊脂糖凝膠電泳取8μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,在2%(W/V)瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml溴化乙錠),用電壓降5V/cm電泳30～45min,紫外燈下直接觀察DNA帶紋。1.2.3聚丙酰胺凝膠法PCR產(chǎn)物稀釋2～4倍,然后與等體積2倍加樣緩沖液(97%甲酰胺,20mmol/L乙二胺四乙酸,0.05%溴酚藍(lán)及二甲苯氰)混合,于96℃變性5min后置于冰上冷卻5min,然后立即取2～4μl混合物分別在6%和8%的聚丙酰胺凝膠(40cm×30cm×1mm,含10%甘油)于室溫下或15℃下30W電泳8～9h。凝膠用銀染顯色后分析DNA帶紋。1.2.4聚丙酰胺凝膠電泳PCR產(chǎn)物經(jīng)2%(W/V)瓊脂糖凝膠(含0.5μg/ml溴化乙錠)電泳確認(rèn)后,取5μl加2USau3AI,37℃消化3～4h,消化產(chǎn)物在8%的聚丙酰胺凝膠30W電泳1～2h。凝膠用銀染色法顯色后分析DNA帶紋。1.2.5dna測(cè)試序列經(jīng)SSCP分析異常條帶作DNA測(cè)序。片段經(jīng)純化后,經(jīng)自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。2致突變患者的歷史年齡在140例LHON先證者中,130例(92.9%)為G11778A位點(diǎn)突變,男113人,女17人;2例(1.4%)為G3460A位點(diǎn)突變,男1人,女1人;8例(5.7%)為T14484C位點(diǎn)突變,男6人,女2人。無(wú)先證者攜帶1個(gè)以上突變位點(diǎn)。140例LHON先證者的3個(gè)原發(fā)致病位點(diǎn)突變均為純合突變。在140例3個(gè)原發(fā)致病位點(diǎn)突變的LHON先證者中,57例有家族史,占40.7%。其中53例為G11778A位點(diǎn)突變,占G11778A位點(diǎn)突變患者總數(shù)的40.8%;4例為T14484C位點(diǎn)突變,占T14484C位點(diǎn)突變患者總數(shù)的50.0%。MSP-PCR瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果:4、5、6泳道均可見(jiàn)G3460A突變陽(yáng)性條帶;8、9泳道可見(jiàn)G11778A突變陽(yáng)性條帶(圖1)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HA-SSCP分析結(jié)果:與對(duì)照組相比,3、4、5、6、7泳道均見(jiàn)異常條帶(圖2)。限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ酶切后電泳分析T14484C位點(diǎn)結(jié)果:2、3、4泳道顯示T14484C突變陽(yáng)性,其余為陰性(2、3、4失去酶切位點(diǎn),不能被切割;5、6、7、8被切割成190bp和18bp2個(gè)片段,其中18bp片段已出膠)(圖3)。DNA熒光自動(dòng)測(cè)序結(jié)果:G11778A位點(diǎn)突變G→A(圖4a),G3460A位點(diǎn)堿基突變G→A(圖4b),T14484C位點(diǎn)突變T→C(圖4c)。3不同種人的tcda基因突變1871年德國(guó)眼科醫(yī)生Leber首先描述了一種遺傳性眼病,主要表現(xiàn)為雙眼急性或亞急性中心視力下降,常累及青年男性。隨后便將此病命名為L(zhǎng)HON。該病遺傳方式特殊,僅通過(guò)母系遺傳,現(xiàn)在確認(rèn)此種遺傳是由于線粒體組DNA發(fā)生了突變。自G11778A位點(diǎn)突變被報(bào)道后,又發(fā)現(xiàn)了近20種mtDNA突變位點(diǎn)。基于遺傳、臨床表現(xiàn)、生化等研究,其中G11778A、G3460A、T14484C3個(gè)位點(diǎn)突變被認(rèn)為是原發(fā)性突變,可以單獨(dú)致病,他們的表達(dá)會(huì)大大增加致盲的可能性。而且未在正常人群中發(fā)現(xiàn)。它們分別導(dǎo)致ND1、ND4、ND6線粒體基因編碼呼吸鏈復(fù)合物I亞單位的7個(gè)基因中的3個(gè)基因的改變。其它突變被認(rèn)為是繼發(fā)性突變,可在正常人群中存在,但頻率遠(yuǎn)低于LHON患者。在不同人種中,G11778A突變平均占LHON患者的40%～90%,被認(rèn)為是最常見(jiàn)的原發(fā)突變。在白種人LHON患者中此突變常見(jiàn),而且G11778A突變的家系中約80%患者是男性。但是在不同人種中其頻率不同,G11778A突變占白種人患者突變的50%以上。Mackey等曾報(bào)道:G11778A突變占澳大利亞或新西蘭患者75%,英國(guó)或北愛(ài)爾蘭患者72%,荷蘭患者60%,丹麥患者86%,芬蘭患者50%。而在亞洲G11778A約占LHON患者的90%,G11778A的亞洲家系中79%是男性。G3460A、T14484C所占比例卻很少。在亞洲人中,G11778A位點(diǎn)突變?cè)谌毡净颊咧屑s為87%,而G3460A、T14484C突變率分別為4%、9%。中國(guó)人群中,LHON患者的G3460A、T14484C位點(diǎn)的突變雖有少量報(bào)道,但突變率還未被確定。我們對(duì)140例中國(guó)人LHON先證者進(jìn)行mtDNA3個(gè)原發(fā)致病突變G11778A、G3460A和T14484C位點(diǎn)的突變情況,發(fā)現(xiàn)其突變率分別為92.9%、1.4%和5.7%,與日本、中國(guó)臺(tái)灣和南韓作者報(bào)道的大致相同。而在白種人中,3種原發(fā)性突變分別占50%～70%、8%～25%、10%～15%。說(shuō)明LHON患者3種mtDNA原發(fā)性突變的頻譜存在著種族差異。傳統(tǒng)認(rèn)為L(zhǎng)HON與家族遺傳有關(guān),但是現(xiàn)在看來(lái)有許多病例都是散發(fā)病例。在白種人中,3種原發(fā)突變并且伴有家族史的比例分別為:G3460A突變中有71%～78%有家族史,G11778A中有43%～53%,T14484C中有65%～100%有家族史。而該比率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于日本人,在日本人中,有家族史的占45.6%,對(duì)于G3460A,G11778A,T14484C3種突變伴有家族史