H5N6亞型禽流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法_第1頁(yè)
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1CT值CYCLETHRESHOLD，反應(yīng)管的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定DEPCDIETHYLPROCARBONATERT-PCRREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION熒光信號(hào)；而反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq酶發(fā)揮5’→3’的外切核酸酶功能，上的熒光基團(tuán)游離出來(lái)，所發(fā)出的熒光不再為淬滅基團(tuán)所吸收而被檢測(cè)儀所接收。25.2.1試劑級(jí)別HAPb：5’FAM-TCWACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA-BHQ1-3’HAFP：5’ACRTATGACTAYCCACARTAYTCAG3’HARP：5’AGACCAGCTAYCATGATTGC3’NAPb：5’HEX-CCAATAACAGGAGGGAGCCCAGACCC-BHQ1-3’NAFP：5’CCCCACCAATGGGAACTG3’NARP：5’TCTAGGAATGCAAACCCTTTTACC3’5.2.5其他試劑樣品的采集、保存及運(yùn)輸應(yīng)符合GB19489、GB/T3將兩個(gè)滅菌的棉拭子于PBS溶液中浸濕，取一個(gè)棉拭子先插入活禽喉頭口及上腭裂來(lái)回刮3～5次并旋轉(zhuǎn)2～3次；將咽喉拭子和泄殖腔棉拭子一起放入盛有1mL滅菌的0.01moL/LpH7.2PBS(內(nèi)含青霉素將所采組織病料置于潔凈、滅菌并烘干的研磨器中，按質(zhì)量體積比（1:1）加入樣品保存液進(jìn)行充4H5N6亞型禽流感病毒核酸提取也可以采用等效RNA提取試劑及方法：如采用自動(dòng)化核酸抽提儀和配9.1反應(yīng)體系配置（附錄B以AgPath-IDTMOne-StepRT-PCR試劑盒為例，列出反應(yīng)體系配制表，僅供參考）將配制的每9.2.2.1反應(yīng)條件設(shè)定9.2.2.2通道選擇在試驗(yàn)成立的條件下，F(xiàn)AM及HEX通道結(jié)果均呈現(xiàn)Ct值≤35且呈現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判為熒光PCR陽(yáng)性5檢測(cè)經(jīng)40個(gè)循環(huán)無(wú)Ct值且不出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，或者只出現(xiàn)單一通道有熒光信號(hào)，判為熒光PCR陰性反6A.10.01mol/LPBS(pH7.

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