大豆糖肽抑制致病菌粘附機(jī)制及穩(wěn)定性研究

大豆糖肽抑制致病菌粘附機(jī)制及穩(wěn)定性研究大豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白資源,在保障我國(guó)膳食蛋白質(zhì)供給方面發(fā)揮著重要作用。大豆蛋白及其降解產(chǎn)物具有調(diào)節(jié)胃腸道健康的功能。本研究室前期以堿性蛋白酶酶解大豆糖蛋白(8-伴大豆球蛋白),并從p-伴大豆球蛋白酶解物中分離大豆糖肽(SGP),且發(fā)現(xiàn)SGP具有抑制細(xì)菌粘附和調(diào)節(jié)腸粘膜屏障功能的活性,但是SGP具有抑制粘附作用的機(jī)制并不清楚,糖鏈在抑制粘附中發(fā)揮的作用也不明確。本課題在前期研究基礎(chǔ)上,分析SGP與宿主細(xì)胞的相互作用,評(píng)價(jià)糖鏈在抑制粘附中發(fā)揮的作用,進(jìn)一步探討SGP抑制粘附的機(jī)制,為建立SGP的生理活性調(diào)控方法和應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新提供理論依據(jù)；在明確理論問(wèn)題的基礎(chǔ)上,研究具有維持腸道健康作用的p-伴大豆球蛋白酶解物在模擬體外消化過(guò)程中以及在熱處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性,在技術(shù)層面上為β-伴大豆球蛋白酶解物作為食源肽類胃腸道調(diào)節(jié)劑或功能因子添加于各種類型的食品中提供基礎(chǔ)。本研究首先采用高碘酸鹽氧化的方法制備了糖鏈破壞的大豆糖肽,并對(duì)破壞糖鏈的大豆糖肽性質(zhì)進(jìn)行了分析,結(jié)果表明高碘酸鹽處理后的SGP中總糖相對(duì)含量由15.44%下降至10.93%,樣品負(fù)電性增強(qiáng),分子量相對(duì)較低的組分含量增加,疏水性相對(duì)較強(qiáng)的組分含量增加；高碘酸鹽處理后,樣品中芳香族氨基酸的暴露狀態(tài)發(fā)生了變化,表明高碘酸鹽氧化不僅可以部分破壞糖鏈,還會(huì)引起樣品構(gòu)象的變化。以Caco-2細(xì)胞為模型,研究了SGP與Caco-2細(xì)胞的相互作用。結(jié)果表明,細(xì)胞表面Zeta電位值在添加SGP的30min內(nèi)降低,后在24h內(nèi)緩慢回復(fù)至加入肽前的水平；熒光結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SGP能夠結(jié)合于細(xì)胞膜表面,增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性。細(xì)胞膜上的脂筏區(qū)域被破壞后,SGP與細(xì)胞膜的結(jié)合作用明顯減弱,表明SGP在細(xì)胞膜的脂筏區(qū)域與細(xì)胞膜發(fā)生結(jié)合作用。進(jìn)一步比較SGP和periodate-treatedSGP對(duì)致病菌粘附腸道細(xì)胞的抑制效果。結(jié)果表明,periodate-treatedSGP對(duì)實(shí)驗(yàn)所用Escherichiacoli0114、Escherichiacoli026、Salmonellaenteritidis、S.typhimuriumLT2四株常見的腸道致病菌有一定的抑制粘附的活性。高碘酸鹽氧化破壞糖鏈后對(duì)大腸桿菌粘附的抑制效果明顯下降,對(duì)沙門氏菌粘附的抑制效果則影響不明顯；且periodate-treatedSGP對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性增加的程度小于完整的SGP。這些結(jié)果意味著糖鏈在大豆糖肽抑制大腸桿菌粘附細(xì)胞的作用中發(fā)揮了重要作用。β-伴大豆球蛋白酶解物的穩(wěn)定性是將其應(yīng)用于食品生產(chǎn)的基礎(chǔ),本研究分析了其在熱處理(85℃,30min)條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明加熱會(huì)導(dǎo)致β-伴大豆球蛋白酶解物發(fā)生可溶性聚集,且聚集程度與溶液濃度有關(guān)；較低濃度時(shí)(小于200mg/mL),β-伴大豆球蛋白酶解物溶液有良好的耐熱性；在較高濃度時(shí),加熱會(huì)導(dǎo)致β-伴大豆球蛋白解物在胃腸道消化酶的作用下的降解作用。結(jié)果表明,在模擬消化過(guò)程中,肽段發(fā)生了部分酶解物負(fù)電性增加,鈣敏感性下降。進(jìn)一步采用體外模擬消化的方式研究了β-伴大豆球蛋白酶降解,但是降解的程度較低,其中10-20kDa組分含量保持相對(duì)穩(wěn)定。親水性相對(duì)較強(qiáng)的組分含量略有減少,疏水性較強(qiáng)的組分略有增加,但整體表面疏水性指數(shù)沒有顯著變化(