十一哺乳動物骨髓細胞染色體畸變實驗

十一、哺乳動物骨髓細胞染色體畸變實驗InVivoMammalianBoneMarrowCellChromosomeAberrationTest1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了哺乳動物骨髓細胞染色體畸變實驗的大體原那么、要求和方式。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測化妝品原料及其產(chǎn)品的遺傳毒性。2標(biāo)準(zhǔn)性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(No.475,April1997)3實驗?zāi)康谋緦嶒炇且豁椫峦蛔冃詫嶒?，檢測整體動物骨髓細胞染色體畸變，以評判受試物致突變的可能性。4概念染色體型畸變(Chromosome-typeaberration):染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為在兩個染色單體的相同位點均顯現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。染色單體型畸變(Chromatid-typeaberration)：染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。染色體數(shù)量改變(Numerical-fypeaberration):哺乳動物細胞正常染色體數(shù)量的改變。5實驗大體原那么使哺乳動物(如大鼠或小鼠)經(jīng)口或其它適宜途徑染毒，動物處死前用細胞割裂中期阻斷劑處置，處身后制備骨髓細胞染色體標(biāo)本，分析染色體畸變。6實驗方式實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境：選用健康成年大鼠或小鼠，每組每種性別至少5只。實驗動物及實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。受試物受試物配制：固體受試物應(yīng)溶解或懸浮于適合的溶劑中，并稀釋至必然濃度。液體受試物

可直接利用或予以稀釋。受試物應(yīng)在利用前新鮮配制，不然就必需證明貯存不阻礙其穩(wěn)固性。溶劑的選擇：溶劑在所選用濃度下，不引發(fā)毒性效應(yīng)，不與受試物發(fā)生化學(xué)反映。首選為水溶性溶劑。劑量設(shè)置：應(yīng)進行預(yù)實驗以選擇最高劑量。當(dāng)有毒性時，能夠引發(fā)死亡或抑制骨髓細胞有絲割裂指數(shù)(50%以上)為指標(biāo)確信最高劑量。在第一次搜集樣品時，需設(shè)置3個可供分析的劑量，在第二次搜集樣品時，那么僅需設(shè)置最高劑量組。若是一次劑量為2000mg/kg體重時仍未引發(fā)毒性效應(yīng)，那么只設(shè)2000mg/kg體重劑量組。對照：在每項實驗中，對每種性別均應(yīng)設(shè)陰性對照組和陽性對照組。除不利用受試物外，其它處置與受試物組一致。陰性對照：除設(shè)溶劑對照(即僅含溶劑)夕卜，若是沒有文獻資料或歷史性資料證明所用溶劑不具有有害作用或致突變作用，還應(yīng)設(shè)空白對照組。陽性對照：陽性對照物應(yīng)能引發(fā)染色體結(jié)構(gòu)畸變率明顯高于背景資料。染毒途徑能夠不同于受試物。所選用的陽性對照物最好與受試物類別有關(guān)。能夠利用下述物質(zhì)：三亞乙基密胺(triethylenemelamine)、甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate)、乙基亞硝基月尿(ethylnitrosonrea)、絲裂霉素C(mytomycinC)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)。染毒方式：可采納經(jīng)口或其它適宜的染毒方式。一樣情形下，染毒1次，但分兩次搜集樣品，即每組動物分兩個亞組，亞組1于染毒后12h~18h處死并搜集第一次樣品；亞組2于亞組1處身后24h搜集第二次樣品。若是采納多次染毒，于末次染毒后12h~18h搜集樣品。于處死動物搜集樣品前腹腔注射細胞割裂中期阻斷劑(如用秋水仙素，于處死前4h，按4mg/kg體重給藥)。實驗步驟用頸椎脫臼法處死動物，掏出股骨，剔除肌肉等組織。剪去股骨兩頭，用注射器吸取5mL生理鹽水，從股骨一端注入，用10mL離心管，從股骨另一端接取流出的骨髓細胞懸液。將細胞懸液以1000r/min的速度離心5min~7min，去除上清液。加入匚KCl溶液7ml，用滴管將細胞輕輕地混勻，放入37°C水浴中低滲處置7min，加A2mL固定液(冰醋酸：甲醇=1:3)，混勻，以1000r/min速度離心5min~7min，棄去上清液。加入7mL固定液，混勻，固定7min，以1000r/min的速度離心7min，棄去上清液。用同法再固定1~2次，棄去上清液。加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。用混懸液滴片，自然干燥。用姬姆薩染液染色。讀片和結(jié)果處置確信有絲割裂指數(shù)：包括所有處置組、陽性和陰性對照組(每只動物計數(shù)1000個細胞)。計數(shù)畸變細胞：對每只動物選擇100個分散良好的中期割裂相，在顯微鏡油鏡下進行讀片。在讀片時應(yīng)記錄每一觀看細胞的染色體數(shù)量，關(guān)于畸變細胞還應(yīng)記錄顯微鏡視野的坐標(biāo)位置及畸變類型。所得各組的染色體畸變率用X2查驗進行統(tǒng)計學(xué)處置，以評判實驗組和對照組之間是不是有顯著不同。結(jié)果評判當(dāng)受試物引發(fā)染色體畸變數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)意義，并有與劑量相關(guān)的增加或在一個劑量組顯現(xiàn)染色體畸變細胞數(shù)明顯增高，那么判定具有致突變性。當(dāng)結(jié)果不能得出，應(yīng)改變實驗條件進一步進行測試。在評判時應(yīng)綜合考慮生物學(xué)意義和統(tǒng)計學(xué)意義。7實驗報告報告應(yīng)包括以下項受試物名稱、理化性質(zhì)、所用溶劑及配制；動物種屬和品系、體重、數(shù)量、性別、來源(注明合格證號和動物級別)；實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；劑量和組別：選擇劑量的原那么、劑量和組別、陰性和陽性對照物及劑量；實驗條件和方式：染毒途徑和染毒方案、細胞毒性測定方式、所用的細胞割裂中期阻斷劑及其劑量和采樣時