課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段課件

課題2多聚酶鏈式反應擴增DNA片斷

多聚酶鏈式反應(PCR技術(shù))，

是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為DNA體外擴增技術(shù)?！锓肿由飳W研究中最強大的實驗技術(shù)之一★其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復制的過程美國科學家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎（一）DNA分子的組成和結(jié)構(gòu)1、基本組成單位是

.共有

種,每個基本單位是由一分子的

、一分子的

、和一分子的

構(gòu)成。脫氧核甘酸4磷酸堿基脫氧核糖一、基礎(chǔ)知識1’2‘3’4‘5’OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基5’3’3’5’堿基脫氧核糖磷酸基團堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖5’3’脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖2、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5'端3'端5'端3'端

識別

DNA分子的3'端與5'端-OH端為3′;磷酸基團的末端為5′。當引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3′端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸。DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從DNA的3′端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復制需要引物。5′3′5′3′（二）DNA的復制1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸高溫變性低溫復性重復1~3步30輪3、DNA復制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5’端向3’端延伸2、步驟：變性——復性——延伸PCR技術(shù)的原理總結(jié)

利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DNA分子的擴增。

體外DNA復制的條件：

四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）、引物、模板；緩沖溶液和嚴格控制溫度的溫控設(shè)備。復制的方向：子鏈的5’端向3’端延伸。5’3’(a)第一輪引物25’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈5’3’引物1互補鏈(b)第二輪變性新引物新延伸3’5’3’5’3’5’5’3’(c)第三輪以第二輪產(chǎn)物為模板，重復第二輪過程。55℃復性4、前三次循環(huán)圖解95℃變性72℃延伸難點解析：DNA聚合酶只能特異地復制處于兩個引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增。5’3’引物1引物2互補鏈引物2引物1互補鏈引物1引物2第一次第二次第三次第四次引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）5、循環(huán)特點：①上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板②結(jié)果含有最初母鏈的DNA只有兩條③其它子代DNA分子都為雙引物分子式④處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長a×2n6.PCR的重要應用：廣泛應用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學、基因克隆和DNA序列測定等。7、體內(nèi)DNA復制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細胞自身的DNA聚合酶TaqDNA聚合酶復制特點半保留復制，邊解旋邊復制。復制整個DNA半保留復制，完全解旋后復制。復制兩引物之間的DNA序列復制的方向子鏈的5’端向3’端延伸子鏈的5’端向3’端延伸二、PCR反應的實驗操作1、PCR儀（一）設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器1.準備2.移液㈡.實驗操作步驟按照PCR反應體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上。用微量移液器按照PCR反應體系配方往微量離心管里面加入各種試劑?；旌虾笊w嚴微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁，使反應液混合均勻。3.混合⑴過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。4.離心⑵離心目的：使反應液體集中在離心管底部，提高反應效果。將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。5.反應循環(huán)數(shù)變性復性延伸第一次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟──變性、復性和延伸.PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6.注意事項⑴隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；⑵分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭（一）理論上DNA擴增數(shù)目的計算四、課題成果評價1、一條DNA，復制n次，DNA為2n2、

a條DNA，復制n次，DNA為ax2n（二）實驗中DNA含量的測定1、原理可以通過測量DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)2、過程①稀釋2μL

PCR反應液，加入98μL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋②對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100μL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值③測定并計算DNA含量（

g/mL）＝50×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1,則DNA

的含量為50g/ml的課堂小結(jié)多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響PCR過程變性復性延伸操作步驟配制PCR反應體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴增測定含量稀釋調(diào)零測定并讀數(shù)計算五.課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出特點練習鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應用，錯誤的一項是A古生物學、刑偵破案、DNA序列測定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學CDNA序列測定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點是A原理簡單