維生素B2的含量測量

熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素B2的含量實驗目的學習熒光分光光度法測定多維葡萄糖粉中維生素E2的分析原理。掌握熒光分光光度計的操作技術(shù)和測定多維葡萄糖粉中維生素B2的方法。實驗原理維生素E2（又叫核黃素，VB2）是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶，其結(jié)構(gòu)式為：維生素B2易溶于水而不溶于乙瞇等有機溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430?440nm藍光的照射下，發(fā)出綠色熒光,其峰值波長為525imioVB2的熒光在pH=6?7時最強，在pH=ll時消失。維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射會發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，光黃素的熒光比核黃素的熒光強的多，故測VE2的熒光時溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進行。多維葡萄糖中含有維生素El、E2、C、D2及葡萄糖，其中維生素C和葡萄糖在水溶液中不發(fā)熒光，維生素B1本身無熒光，在堿性溶液中用鐵輒化鉀氧化后才產(chǎn)生熒光，維生素D2用二氯乙酸處理后才有熒光，他們都不干擾維生素E2的測定。熒光分析法常溫下，處于基態(tài)的分子吸收一定的紫外可見光的輻射能成為激發(fā)態(tài)分子，激發(fā)態(tài)分子通過無輻射躍遷至第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級，再以輻射躍遷的形式回到基態(tài)，發(fā)出比吸收光波長長的光而產(chǎn)生熒光。在桶溶液中，熒光強度IF與物質(zhì)的濃度c有以下的關(guān)系：IF=2.303舛。動c當實驗條件一定時，熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成線性關(guān)系：If=Kc這是熒光光譜法定量分析的理論依據(jù)。熒光分析法的特點與紫外-可見分光光度法比較，熒光分析法具有更高的靈敏度。選擇性好，熒光法既能依據(jù)發(fā)射光譜，又能依據(jù)吸收光譜來鑒定物質(zhì)。所需試樣量少，操作方法簡便。物質(zhì)發(fā)光的必要條件必須有吸收結(jié)構(gòu),即要有n-n*躍遷和n-n*躍遷的結(jié)構(gòu)，具有大的共軌兀鍵結(jié)構(gòu)，具有剛性的平面結(jié)構(gòu)，具有較高的量子產(chǎn)率e。熒光光譜激發(fā)光譜固定測量波長（選最人發(fā)射波長），化合物發(fā)射的熒光強度與照射光波長的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最人。發(fā)射光譜固定激發(fā)光波長（選最人激發(fā)波長），化合物發(fā)射的熒光強度與發(fā)射光波長關(guān)系曲線。固定發(fā)射光波長進行激發(fā)光波長打描，找出最人激發(fā)光波長，然后固定激發(fā)光波長進行熒光發(fā)射波長掃描，找出最人熒光發(fā)射波長。激發(fā)光波長和發(fā)射熒光波長的選擇是本實驗的關(guān)鍵。熒光儀常用的熒光分析儀器由激發(fā)光源、單色器、液槽、檢測器和顯示記錄器五部分構(gòu)成熒光分析儀器與分光光度計比較主要差別有兩點：久熒光分析儀器采用垂直測量方式，以消除透射光的影響；b.熒光分析儀器有兩個單色器，能夠獲得單色性較好的激發(fā)光并消除其它雜散光干擾。實驗儀器口立R-7000熒光儀5niL吸量管1只，2niL吸量管1只，50niL容量瓶7只10.0ug-niL-lVB2標準溶液（置陰暗處保存），冰乙酸（AR）,多維葡萄糖粉試樣實驗步驟打開氛燈，再打開主機，然后打開計算機啟動工作站并初始化儀器。儀器初始化完畢后，在工作界面上選擇測量項目，設(shè)置適當?shù)膬x器參數(shù)：樣品測定，利用濃度最人的標準溶液測定最大激發(fā)光波長與熒光波長。4按照從小到人的順序，.測定標準溶液的熒光強度，每次樣品測量三次，測量后比色皿用超純水清洗干凈。5測定未知樣品的濃度，測量三次熒光強度，測量完成。6退出主程序，關(guān)閉計算機，先關(guān)主機，最后關(guān)毎燈（一般測定完30分鐘后關(guān)閉，要等光源冷卻下來再關(guān)閉）。標準溶液的配置標準系列溶液的配制及標準溶液熒光強度的測定：在六個干凈的50mL容量瓶中，分別吸取0.50、1.00、1.50,2.00、2.50和3.00mLVB2標準溶液（lO.Oug?mLJVB2），各加入2.00niL冰乙酸（在通風櫥中加入），橋釋至刻度,搖勻。從稀到濃測量系列標準溶液的熒光強度。未知試樣的測定：稱取0.1672g多維葡萄糖粉試樣,用少量超純水水溶解后轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，加2.00niL冰乙酸，桶釋至刻度，搖勻。用測定標準系列時相同的條件，測量其熒光強度。數(shù)據(jù)處理最人發(fā)射波長：536

標準溶液的熒光強度Cug/ml0.10.20.30.40.50.6Wavelengthmil74.70151.63224.96297.16366.57432.833待測溶液的熒光強度編號123平均Wavelengthnm149.1150.0149.6149.56可以求出待測溶液的濃度為VB2的分子量為376.36,可以求出VB2的總重為可以求出多維葡萄糖中VB2的含量為思考題試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因。由于現(xiàn)代電子技術(shù)具有檢測十分微弱光信號的能力，并且熒光強度與激發(fā)光強度成正比，提高激發(fā)光強度也町以增人熒光強度，使測定的靈敏度提高；而吸收光度法測定的是吸光度,不管是増人入射光強度，還是提高檢測器的靈敏度，都會使透射光信號與入射光信號以同樣的比例增大，吸光度值不會改變，因此靈敏度不能提高本實驗為何在酸性溶液中測定維生素B2?在堿性溶液中加熱極易被破壞，而在酸性溶液中則對熱穩(wěn)定，由于維生素B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射，會發(fā)生光分解而轉(zhuǎn)化為光黃素，后者的熒光比核黃素的熒光強的多，因此，測屋維生素E2的熒光時，溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且須在避光