工業(yè)微生物育種資料

第一章：緒論一、發(fā)酵工程1、概念：利用微生物的特定性狀，通過現(xiàn)代工程技術(shù)，生產(chǎn)有用物質(zhì)一種技術(shù)系統(tǒng)。一般是在發(fā)酵罐中生產(chǎn)，是生物加工和生物制造實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的核心技術(shù)。2、突出特點(diǎn)：①以可再生資源為原材料；②反響條件溫和〔相比化學(xué)合成〕多為常溫常壓，反響能耗低、選擇性好、效率高的生產(chǎn)過程；③環(huán)境污染少，不產(chǎn)生重金屬、有害化學(xué)物質(zhì)；④投資較小(與反響條件直接相關(guān)〕⑤能生產(chǎn)目前化學(xué)生產(chǎn)不能生產(chǎn)或者生產(chǎn)困難的性能優(yōu)異的產(chǎn)品。所以發(fā)酵工程已成為工業(yè)領(lǐng)域重點(diǎn)開展的行業(yè)。Eg:Aas,vit與有機(jī)酸、抗生素等。3、中國(guó)發(fā)酵工程的現(xiàn)狀：有一定的根底，但參差不齊與國(guó)外差距大，就產(chǎn)量而言，主要是糖化酶，高溫α-ainylase,堿性蛋白酶，以糖化酶為例，自1988年引進(jìn)高產(chǎn)的菌株后，發(fā)酵水平一直鮮有提高，酶活性仍停留在3500u/ml左右。而國(guó)外已到達(dá)50000u/ml以上。由于劑型單一及質(zhì)量不穩(wěn)定，中國(guó)酶制劑產(chǎn)品很難進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)，也擋不住國(guó)際市場(chǎng)產(chǎn)品進(jìn)入國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，總的來說，中國(guó)生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化程度很低，科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的周期長(zhǎng)，速度慢，技術(shù)水平和裝備水平還有待進(jìn)一步提高等。所以與國(guó)外的差距大，生產(chǎn)本錢明顯高于國(guó)外。4、發(fā)酵工程隊(duì)促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)開展的重要作用。⑴農(nóng)業(yè)：如陳化糧的問題;；⑵能源：如石油的問題；⑶化學(xué)工業(yè)：醫(yī)藥工業(yè)〔中國(guó)兩大支柱產(chǎn)業(yè)〕方面的提高等等。這些方面都能有效地提高民族工業(yè)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，實(shí)現(xiàn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的持續(xù)開展。5、發(fā)酵工程技術(shù)的內(nèi)容。⑴提供高性能生產(chǎn)菌種的菌種技術(shù)；⑵實(shí)現(xiàn)低本錢，大規(guī)模生產(chǎn)產(chǎn)品的發(fā)酵技術(shù)；⑶獲得合格產(chǎn)品的別離提取技術(shù)。二、工業(yè)微生物育種在發(fā)酵工業(yè)中的地位。工業(yè)微生物：應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)的微生物，是指通過工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)能夠特定產(chǎn)品或者到達(dá)特定社會(huì)目標(biāo)的微生物。菌種技術(shù)的內(nèi)容：⑴菌種篩選技術(shù)；⑵菌種選育技術(shù)；⑶菌種保藏技術(shù)。篩選是指從自然界中獲得具有生產(chǎn)目的產(chǎn)物的菌株；選育是指提高菌株生產(chǎn)性能；保藏那么是指保證菌種生產(chǎn)能力能長(zhǎng)時(shí)間維持。這些都是育種學(xué)的內(nèi)容。Bac育種的必要性：菌種是發(fā)酵的根底，是生產(chǎn)的役馬。既是發(fā)酵過程成敗的關(guān)鍵，更是表達(dá)經(jīng)濟(jì)效益和工作效益的關(guān)鍵，一個(gè)好的工業(yè)菌種可以形成和開展出一個(gè)工業(yè)形成一個(gè)產(chǎn)業(yè)；同樣，現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)的開展，也不斷要求有新的性能更優(yōu)越的工業(yè)菌種的出現(xiàn)。⑴人類社會(huì)可持續(xù)開展的需要。大自然中Bac資源及其豐富，據(jù)估計(jì)，地球上Bac的種類有106到107種，而被人類了解的僅占10%全世界被描述的Bac種類僅占實(shí)際的2%，目前被人類利用的Bac僅占總量的1%，人類為了自身的生存與開展，必須從自然界中索取各種資源加以利用。現(xiàn)在，人口急劇膨脹，工業(yè)化速度加快，自然資源特別是礦物質(zhì)能源過度，過快地被消耗，環(huán)境污染日趨嚴(yán)重等問題，迫使人們加速開發(fā)Bac資源。利用Bac增產(chǎn)糧食，提供新的蛋白質(zhì)資源、生產(chǎn)工業(yè)乙醇及氫氣等潔凈能源。加速環(huán)境治理，比方利用Bac初級(jí)代謝和次級(jí)代謝產(chǎn)物，如抗生素、Aas、酶、有機(jī)酸等。⑵發(fā)酵工業(yè)開展的需要。例如：青霉素發(fā)酵水平的提高，弗萊明在20世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)青霉素時(shí)，所產(chǎn)青霉素的菌種為青霉菌，發(fā)酵單位為2u/ml,1943年，美國(guó)最早使用黃青霉，所產(chǎn)青霉素的單位為250u/ml。后來Demerce用X射線誘變黃青霉菌株，得到青霉素單位為500u/ml。20世紀(jì)80年代，青霉素效價(jià)為85000u/ml。⑶是中國(guó)發(fā)酵工業(yè)的現(xiàn)實(shí)需要。國(guó)內(nèi)菌株的發(fā)酵水平與國(guó)外相比總的來說還比擬落后，發(fā)酵產(chǎn)品的品種也較少，如酶制劑。丹麥的諾維公司生產(chǎn)有α-amylase糖化酶、蛋白酶、果膠酶、核酸酶、纖維素酶等品種，盡各種規(guī)格即達(dá)100多種，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的一直是三大當(dāng)家酶種，即糖化酶、α-amylase和蛋白酶。此外，再加上近年來陸續(xù)開發(fā)的少量品種如纖維素酶、凝乳酶、異構(gòu)酶等，品種數(shù)量到達(dá)30多種。但淀粉酶的產(chǎn)量占酶制劑總量的75%，其他酶類那么更是，品種也不全，產(chǎn)品結(jié)構(gòu)不合理，遠(yuǎn)不能滿足各行各業(yè)的需要。菌種選育的意義。⑴決定發(fā)酵產(chǎn)品能否具有工業(yè)的價(jià)值；⑵是發(fā)酵成敗與否的關(guān)鍵；⑶是提高發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量增加了產(chǎn)品的品種的關(guān)鍵。工業(yè)Bac菌種的生產(chǎn)要求。穩(wěn)：⑴遺傳穩(wěn)定，有利于產(chǎn)品優(yōu)良性狀的傳遞；⑵性能穩(wěn)定，能保持較長(zhǎng)的良好經(jīng)濟(jì)性能，菌種的優(yōu)良性能不易退化；⑶目的產(chǎn)物的產(chǎn)量穩(wěn)定，不隨生產(chǎn)批次的改變而改變；⑷繁殖快，易產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、孢子或其他繁殖體；⑸菌種生長(zhǎng)快，種子的生長(zhǎng)必須旺盛，在短時(shí)間內(nèi)就能到達(dá)產(chǎn)品最正確生產(chǎn)期；⑹目的產(chǎn)物產(chǎn)生的時(shí)間快，產(chǎn)生目的產(chǎn)品的時(shí)間短，即發(fā)酵時(shí)間短，提高生產(chǎn)效益；純：⑺菌種純。是純種，防止產(chǎn)品含有雜質(zhì)，防止發(fā)生倒灌；易：⑻菌種易別離提純〔以獲得純種，而且一旦感染上雜菌，能容易別離純化〕；⑼易于突變，對(duì)誘變劑敏感，有利于菌種加強(qiáng)；強(qiáng)：⑽抵抗能力強(qiáng)，有自身保護(hù)機(jī)制，能抵抗雜菌污染。即穩(wěn)、快、純、易、強(qiáng)。只有具備了這些條件的菌株，才能保證發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。這既是發(fā)酵工業(yè)的最低要求，也是發(fā)酵工業(yè)的最大目的。三、遺傳學(xué)的形成和開展。遺傳學(xué)時(shí)生命科學(xué)領(lǐng)域中一門核心學(xué)科。主要研究?jī)?nèi)容：①遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)；②遺傳信息的傳遞；③遺傳信息的功能；④遺傳信息的表達(dá)。分類：①傳遞遺傳學(xué)，級(jí)經(jīng)典遺傳學(xué)。主要研究遺傳物質(zhì)縱向傳遞的規(guī)律及基因型與表型的關(guān)系；②分子遺傳學(xué)。主要研究基因結(jié)構(gòu)，功能和縱向傳遞〔結(jié)構(gòu)是指其化學(xué)本質(zhì)與精細(xì)結(jié)構(gòu)，功能指他的表達(dá)、調(diào)控、重組和變異〕；③群體遺傳學(xué)，研究群體中基因頻率和基因型頻率以及影響其平衡的各種因素。特點(diǎn)：①推理性強(qiáng)，是一門推理性的學(xué)科。遺傳學(xué)的研究方法是根據(jù)自然現(xiàn)象和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推理出一種假設(shè)，然后通過實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證；②多學(xué)科交叉與融合。遺傳學(xué)主要建立在生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的根底上，但又涉及生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域；③開展快。遺傳學(xué)的開展非?？?，新理論、新技術(shù)、新成果層出不窮；④應(yīng)用性強(qiáng)。轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的周期短，以其為理論根底，已派生出許多應(yīng)用學(xué)和植物等微生物育種學(xué)、優(yōu)生學(xué)、生物工程等。遺傳學(xué)的開展。遺傳學(xué)的開展大致可分為三個(gè)時(shí)期：⑴細(xì)胞遺傳學(xué)時(shí)期〔1910-1940〕。此時(shí)期主要是確立了遺傳學(xué)的染色體說。摩爾根提粗了連鎖交換定律，并確定基因直線排列在染色體上，形成經(jīng)典遺傳學(xué)的理論體系；⑵微生物遺傳學(xué)和生化遺傳學(xué)時(shí)期〔1941-1969〕。這一時(shí)期的特點(diǎn)是遺傳學(xué)研究的對(duì)象從真核生物轉(zhuǎn)向原核生物，并更深入地研究基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)和生化功能；⑶分子遺傳學(xué)時(shí)期〔1953雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的建立到現(xiàn)在〕四、工業(yè)微生物育種的進(jìn)展?！惨弧彻I(yè)微生物育種的根底：遺傳與變異。所謂遺傳是指親代和子代相似的現(xiàn)象，而變異是指親代與子代之間或同一親代產(chǎn)生的不同子代之間存在的某種差異，變異提供遺傳的材料，遺傳那么保證優(yōu)良性狀的積累?！捕彻I(yè)微生物育種技術(shù)的開展階段。1、自然選育：自然選育是不經(jīng)人工處理而利用微生物的自發(fā)突變進(jìn)行的純種別離方法。單菌落別離，是一種簡(jiǎn)單易行的育種方法。例如：酒精發(fā)酵，利用自然選育純種是酒精生產(chǎn)穩(wěn)定〔包括性能、產(chǎn)量、生產(chǎn)時(shí)間等方面的穩(wěn)定〕但是突變頻率高與低，存在很大局限性。2、誘變育種〔上世紀(jì)90年代〕以人工誘發(fā)基因突變?yōu)楦椎挠N技術(shù)。例如：抗生素的生產(chǎn)，特別是青霉素生產(chǎn)。誘變育種到目前為止還是很重要的育種方法，尤其是發(fā)酵工業(yè)中優(yōu)良高產(chǎn)菌株的選育。3、雜交育種〔20世紀(jì)40年代〕微生物的雜交育種不是簡(jiǎn)單的物種之間優(yōu)良性狀的組合而是建立在誘變育種的根底上，而且克服生物物種之間相似性的影響〔即親和性〕。雜交不僅發(fā)生在種內(nèi)，也可以成功地發(fā)生在種間和屬間。雜交主要是消除誘變劑的“疲勞效應(yīng)〞等副反響，集不同菌株的優(yōu)良性狀于一體。4、推理育種?！?0世紀(jì)50年代〕又稱代謝控制育種。是根據(jù)微生物代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，通過人工誘發(fā)突變的技術(shù)，篩選獲得改變微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地是目標(biāo)代謝產(chǎn)物選擇性地大量合成和積累的技術(shù)，以谷氨酸發(fā)酵為標(biāo)志，意味著誘變由盲目性走向理性。5、代謝工程育種〔即傳統(tǒng)意義的基因工程育種〕利用基因重組技術(shù)對(duì)細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行有目的的定向修飾，先對(duì)細(xì)胞的分解和合成代謝中的多步級(jí)聯(lián)反響進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，然后利用DNA重組技術(shù)強(qiáng)化或滅活控制代謝途徑的相關(guān)基因。6、基因組重排育種〔基因組改組〕是2002年新報(bào)道的對(duì)微生物整個(gè)基因進(jìn)行重排的育種方法。采用的具體方法是先用誘發(fā)突變或點(diǎn)突變技術(shù)產(chǎn)生復(fù)雜子代組合庫(kù)，然后采用循環(huán)原生質(zhì)體融合，使其產(chǎn)生同源重組，產(chǎn)生各種各樣的突變組合。第二章．微生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與分裂第一節(jié)微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能細(xì)胞是生命活動(dòng)的根本單位，一切有機(jī)體〔除病毒外〕都是由細(xì)胞構(gòu)成。細(xì)胞是構(gòu)成有機(jī)體的根本單位；細(xì)胞具有獨(dú)立有序的自控代謝體系，是代謝與功能的根本單位；細(xì)胞是遺傳的根本單位，具有遺傳的全能性。細(xì)胞是多層及非線性的復(fù)雜結(jié)構(gòu)體系，是物質(zhì)與信息、能量過程精巧結(jié)合的綜合體，是高度有序的，具有自組裝和自組織能力的體系。微生物的分類：微生物通常是指那些單細(xì)胞的或由相同組織構(gòu)成的多細(xì)胞有機(jī)體。分為五類：1、病毒。真病毒、類病毒。2、真細(xì)菌〔具有原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)〕古細(xì)菌3、真菌4、藻類。5、原生動(dòng)物體。按細(xì)胞結(jié)構(gòu)及遺傳信息分為真核微生物和原核微生物。細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與功能。功能：①對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用；②維持細(xì)胞行動(dòng)；③對(duì)物質(zhì)的交換起局部調(diào)節(jié)作用〔有些分子能進(jìn)入有些那么不能〕；④決定細(xì)菌的抗原性、致病性急對(duì)病毒的敏感性。1、主要成分。⑴肽聚糖。細(xì)胞壁的有效成分。但G-含量低。①雙糖單位N-acety/glucosamine(G)N-acety/muramicacid(M)G、M以β-1、4糖苷鍵連在一起，該鍵是溶菌酶的作用位點(diǎn)。②短肽。由4個(gè)Aas〔有時(shí)是5個(gè)〕殘基組成，且D型和L型交錯(cuò)出現(xiàn)，一般連在M上。③肽橋。連接前前后后兩個(gè)肽聚糖的一小段Aas.NH2前一短肽中的第4個(gè)Aa相連，而-COOH與后一肽聚糖單位的短肽中的第三個(gè)Aa相連〔青霉素抑制轉(zhuǎn)肽酶的活力，使短肽和肽橋不能形成〕；⑵磷酸壁。G+特有，分兩種類型，即壁磷壁酸和膜磷壁酸，青霉素可阻礙壁磷壁酸中甘油磷酸鏈與肽聚糖分子間進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。膜磷壁酸甘油磷酸鏈與細(xì)胞膜的磷脂共價(jià)結(jié)合。⑶脂多糖〔LPS〕為G-所特有，有類脂A，核心多糖和O-特異性側(cè)鏈三局部組成。LPS是細(xì)菌的內(nèi)毒素，其物質(zhì)根底是類脂A，O-特異性側(cè)鏈決定抗原特異性〔由3-5個(gè)單糖組成的重復(fù)單位聚合而成〕。⑷PW，G-含量多一些，G+那么少一些。2、G+與G-細(xì)胞壁成分及結(jié)構(gòu)的差異。肽聚糖含量高〔G+〕低〔G-〕肽聚糖層層數(shù)多交聯(lián)度高、厚層次少、交聯(lián)度低、薄磷壁？有無Pw低〔約10%〕高〔約60%〕類脂無或少量高〔2%-3%〕誘菌酶分解作用敏感不敏感對(duì)？霉素作用3、缺壁細(xì)胞〔1〕原生質(zhì)體與原生質(zhì)球原生質(zhì)體----------一般由G+形成原生質(zhì)球----------一般由G-形成，還殘留局部細(xì)胞壁〔2〕L-formofbacteria通過自發(fā)突變而形成的遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞壁殘缺型(3)支原體無細(xì)胞壁的G-小型原核生物。是生物界目前能獨(dú)立營(yíng)養(yǎng)的最小型生物?！捕辰湍妇鷆ell壁三明治結(jié)構(gòu)〔Hanno甘露糖〕由葡聚糖、甘露聚糖蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)組成?？捎晌伵Ｏ杆??！踩趁咕鷆ell壁主要由纖維素、幾丁質(zhì)、葡聚糖、少量蛋白質(zhì)組成--蝸牛消化酶水解〔四〕藻類cell壁主要由纖維素、木聚糖、甘露聚糖、雜多糖、脂類構(gòu)成二：細(xì)胞壁以內(nèi)的構(gòu)造〔一〕流動(dòng)鑲嵌型1、特征：具有極性頭部和非極性尾部的磷脂雙分子層是生物膜的根本結(jié)構(gòu)成分Pro.vs不同形式鑲嵌在脂雙分子層的結(jié)合在其外表。Pro的類型.分布的不對(duì)稱性及其與脂分子的些作用是物膜特征和成效的根底。生物膜可以看成是pro在脂分子中的二維溶液2、成分〔1〕膜脂①成分：a.磷脂b.糖脂c.膽固醇和中性脂肪〔細(xì)菌中不念膽固醇，但含有甘油酯特性脂分子〕②膜脂的運(yùn)動(dòng)方式，有4種沿膜平面的側(cè)向運(yùn)動(dòng)b.膜分子繞軸心的自轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)c.脂分子尾部的擺動(dòng)d.雙層脂分子之間的翻轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)〔2〕膜蛋白①．膜周邊蛋白o(hù)r外在蛋白為水活性蛋白?？侩x子鍵or其他較弱的鍵與膜外表的pro.or脂分子結(jié)合。改變?nèi)芤旱腎or提高T。就能從膜上別離下來。膜的結(jié)構(gòu)并不被破壞膜內(nèi)在蛋白o(hù)r整合蛋白與膜結(jié)合相當(dāng)緊密，只有用去污劑才能別離出來。3、膜的流動(dòng)性〔1〕.膜脂的流動(dòng)主要指膜分子的側(cè)向運(yùn)動(dòng)?！?〕.膜蛋白的流動(dòng)成斑現(xiàn)象和成？？現(xiàn)象膜蛋白在脂雙層中的運(yùn)動(dòng)史自發(fā)的熱運(yùn)動(dòng)。不需cell代謝產(chǎn)物的參與，也不需提供能量。4、膜的不對(duì)稱性膜脂的不對(duì)稱性：即同一膜脂分子在脂雙層中不均勻分布膜蛋白的不對(duì)稱性：指酶種膜蛋白分子在cell膜上都有明確的方向性，如cell外表的受體。膜上載體蛋白都是按特定的方向傳遞信號(hào)與物質(zhì)。膜蛋白的不對(duì)稱性是生物膜完成復(fù)雜，有序的各種生理功能的保證5、Cell膜的功能為cell的生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境選擇性的物質(zhì)運(yùn)輸，包括代謝第五的輸入與產(chǎn)物的輸出，其中伴隨E傳遞為多種En〔酶〕提供結(jié)合位點(diǎn)，是En促反響高效有序地進(jìn)行。提供En結(jié)合位點(diǎn)，是酶促反響高效有序地進(jìn)行。參與形成不同功能的cell外表特征結(jié)構(gòu)〔如間體，鞭毛〕？？體又稱中體，多見于G+，主要促進(jìn)cell間隔的形成，并與遺傳物質(zhì)的復(fù)制及其相互別離有關(guān)，是cell外表特征性的一個(gè)結(jié)構(gòu)?！捕臣?xì)胞質(zhì)1.空核Bac的細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)含物〔1〕特點(diǎn)：不流動(dòng)，中間含有內(nèi)含物，包括各種貯藏體、羧酶體、氣泡體等〔2〕貯藏體：由不同化學(xué)成分累積而成的不溶性沉淀顆粒。功能：貯藏營(yíng)養(yǎng)與能量；種類有能沉及能量類、氮源類、磷沉類等2.真核Bac的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器〔1〕線粒體：氧化磷酸化、合成ATP、提供E〔2〕溶酶體：作用于pro糖、脂、核酸等，使其水解，進(jìn)行Cell內(nèi)清等，維持Cell營(yíng)養(yǎng)，防止Bacor異物體侵襲〔3〕微體：①過氧化物酶體、單膜、使cell免受H2O2等過氧化物的毒害。②乙醛酸循環(huán)體，使cell內(nèi)的脂肪通過乙酰CoA和乙醛酸循環(huán)合成糖類or其他cell成分〔4〕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)〔VER〕和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)〔SER〕VER含核糖體，合成分泌性pro和多種膜蛋白SER不含核糖體，合成脂質(zhì)功能：pro合成、脂質(zhì)合成、pro修飾與加工--二硫鍵的形成糖醛化、酰醛化羧醛化？？？？的折疊與裝配〔5〕高醛體①參與Cell分泌活力，對(duì)各種pro自身攜帶的？？信號(hào)識(shí)別進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行分類、包裝、？？②pro的糖醛化及其修飾③pro的水解及其他加工過程〔如將前體加工成有活性的物質(zhì)〕〔6〕液泡貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及水解酶類、調(diào)節(jié)滲透壓3.核糖體合成pro、真核80S〔60S、40S〕、質(zhì)核70S〔50S、30S〕〔三〕細(xì)胞核與質(zhì)粒1.原核生物的核質(zhì)體質(zhì)核Bac沒有膜包圍，但與細(xì)胞質(zhì)有一定的聯(lián)系，一般附于間體上2.真核Bac的細(xì)胞核〔1〕核膜有核小孔、供物質(zhì)選擇性運(yùn)輸，非均勻分布〔2〕核仁合成rRNA，裝配核糖體亞單位〔3〕核基質(zhì)〔4〕染色質(zhì)分裂間期遺傳物質(zhì)的存在形式3.質(zhì)粒獨(dú)立于染色體外的基因組質(zhì)粒的根本特性a.獨(dú)立自主地復(fù)制〔松弛型、嚴(yán)密型〕b.不相密性〔一般情況下同一cell種只存在一類質(zhì)粒〕c.轉(zhuǎn)移性d.非必需性〔對(duì)宿主細(xì)胞而言是非必需的〕在后面的基因工程中主要講集中具體的類型，此處略?！菜摹逞挎吲c伴孢晶體三、cellwall以外的構(gòu)造〔一〕莢膜組成：水〔>70%〕、多糖、多肽、pro功能：a.保護(hù)作用、防枯燥、防吞噬、防噬菌體b.貯藏養(yǎng)料c.堆積代謝廢物d.外表附著〔二〕鞭毛1.細(xì)菌的鞭毛、菌毛、性菌毛鞭毛：運(yùn)動(dòng)、年老的易失去菌毛：吸附功能性菌毛：供體菌DNA轉(zhuǎn)移到受體菌2.真核生物的鞭毛與纖毛：是真核生物cell骨架的成分之一，功能是運(yùn)動(dòng)cell分裂真核Bac細(xì)胞有核仁，進(jìn)行有絲分裂和減數(shù)分裂，細(xì)胞分裂與DNA復(fù)制嚴(yán)格同步Pro細(xì)胞無核仁，進(jìn)行無絲分裂和減數(shù)分裂，細(xì)胞分裂與DNA復(fù)制并不同步1.細(xì)菌的繁殖(1)二分裂，細(xì)菌最普遍，最重要的繁殖方式a.在原間體上形成以新間體〔DNA附在間體上〕b.一股DNA斷裂并以其一端附在新的間體上c.兩股DNA分別復(fù)制成兩分子DNA，與此同時(shí)，cell物質(zhì)增加，cell膜延長(zhǎng)，兩DNA別離d.細(xì)胞中央局部?jī)蓚€(gè)間體之間形成隔膜e.得到兩分子cell〔2〕不等二分裂，如柄細(xì)菌，單一端單毛菌帶鞭毛的細(xì)菌→鞭毛端長(zhǎng)出一個(gè)柄，鞭毛消失→細(xì)菌伸長(zhǎng)，在柄的相對(duì)端長(zhǎng)出一根鞭毛→二分裂形成一帶柄cell和一個(gè)在柄的相對(duì)端極生一根鞭毛的細(xì)菌→有鞭毛的細(xì)菌游走〔3〕出芽生殖；(4)二分裂；〔5〕多分裂G-的蛭弧菌以多分裂存在于宿主中形成多個(gè)子cell2、放線菌的繁殖：大多數(shù)以分生孢子繁殖，有些以菌絲斷裂的方式繁殖真核生物有絲分裂，有性生殖，減數(shù)分裂〔略〕遺傳的物質(zhì)根底遺傳物質(zhì)根底確實(shí)定〔遺傳物質(zhì)的根底是核酸〕肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)噬菌體的感染實(shí)驗(yàn)煙草花葉病毒拆分和重建實(shí)驗(yàn)〔RNA〕染色體真核生物與原核生物的遺傳物質(zhì)的主要區(qū)別真核生物的遺傳物質(zhì)是DNA，而原核生物的那么為DNAorRNA真核生物的染色體由DNA和組蛋白組成，而原核生物的那么由純DNAorRNA組成真核生物的染色體不止一個(gè)，而原核生物往往只要一個(gè)真核生物的染色體為核膜包被，而原核生物那么沒二、DNA在真核生物中的存在狀態(tài)〔一〕染色體1、分類根據(jù)著絲粒的位置分為四類：中著絲粒染色體；近著絲粒染色體；端著絲粒染色體；遠(yuǎn)著絲粒染色體。2、結(jié)構(gòu)〔1〕著絲粒：兩個(gè)染色單體相連的部位，在染色體上的位置固定形成主縊痕〔2〕次縊痕：除主縊痕外，染色體上其他的淺染色縊痕部位，它的數(shù)目位置和大小是某些所特有的特征〔3〕核仁組織區(qū)(NOR)：位于染色體的次縊痕部位，但并非所有的次縊痕部都有NOR〔4〕端粒：染色體兩個(gè)單部特化結(jié)構(gòu)〔5〕隨體：位于染色體末端的球星染色體的末端，有隨體的稱為sat染色體〔二〕染色體外的DNA真核生物染色體外的DNA主要以細(xì)胞器的形式存在。一般都和其他物質(zhì)在一起。細(xì)胞器包括：線粒體、葉綠體、中心體、毛基體、質(zhì)粒、紡錘體等。這些細(xì)胞器存在一些共性成分復(fù)雜〔DNA、RNA、糖、脂、RNA等〕結(jié)構(gòu)復(fù)雜〔葉綠體和線粒體具有復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)，中心粒和毛基體具有微管結(jié)構(gòu)〕功能不一，且與細(xì)胞生命活動(dòng)不可分，作用大數(shù)目多少不一自主復(fù)制一旦消失，后代cell中不再出現(xiàn)〔三〕真核生物染色體結(jié)構(gòu)1、染色體的根本結(jié)構(gòu)單位—核小體〔1〕每個(gè)核小體單位包含200bp左右的DNA超螺旋和一個(gè)組蛋白八聚體。H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)〕及一個(gè)分子的組蛋白H1。〔2〕組蛋白八聚體構(gòu)成核小體的盤狀核心結(jié)構(gòu)〔由四個(gè)二聚體、兩個(gè)H3A、H4形成四聚體，位于核心顆粒中心，兩個(gè)H2A、H2B二聚體位于四聚體兩側(cè)〕〔3〕146bp的DNA分子超螺旋盤繞組蛋白1、75圈，組蛋白H1在核心顆粒外的20bpDNA，鎖住核小體DNA的進(jìn)口和出口，在穩(wěn)定核小體的作用下，H1和166bp的核小體結(jié)構(gòu)又稱染色質(zhì)小體〔4〕兩個(gè)相鄰核小體之間以DNA相連，長(zhǎng)度o-80bp不等，典型長(zhǎng)度60bp〔5〕組蛋白和DNA之間的相互作用主要是結(jié)構(gòu)性的，本不依賴于核苷酸的特異序列，即具有自主裝配的性質(zhì)〔6〕核小體沿DNA的定位受不同因素的影響2、染色體包裝的結(jié)構(gòu)模型〔1〕染色體包裝的多級(jí)結(jié)構(gòu)模型DNA壓縮7倍核小體6倍螺線管40倍超螺線管5倍染色單體〔2〕染色體包裝的放射環(huán)狀結(jié)構(gòu)模型DNA——核小體——螺線管——DNA復(fù)制環(huán)——微帶——染色單體每18個(gè)復(fù)制環(huán)呈放射狀排列，結(jié)合核基質(zhì)形成微帶二、DNA在原核生物中存在的狀態(tài)原核生物的染色體DNA的量遠(yuǎn)小于真核生物，原核生物中，細(xì)菌和放線菌的遺傳物質(zhì)為雙鏈DNA，在病毒中那么有DNAorRNA，是dsorss,呈放射狀or線狀。大腸桿菌染色體dsDNA+pro〔Hu和H2vs〕——超螺旋——功能域環(huán)——腳手架染色體外DNA：質(zhì)粒三、染色體數(shù)目真核生物多為二倍體，原核生物多為單倍體整倍體：個(gè)體中的染色體數(shù)為常數(shù)的整數(shù)倍。如二倍體，三倍體，單倍體非整倍體：指?jìng)€(gè)體中的染色體數(shù)為常數(shù)的非整倍數(shù)。Eg：缺對(duì)性個(gè)體：缺少一對(duì)或幾對(duì)染色體單體性個(gè)體：缺少一對(duì)或幾對(duì)的一條的染色單體二體性個(gè)體：加倍體三體性個(gè)體：一對(duì)或幾對(duì)染色體增加一條染色單體第二節(jié)核酸核酸種類A、T、G、C、U——磷酸核酸——核苷酸————戊糖——核苷————堿基按規(guī)定，DNAorRNA的序列5’寫在右邊，故DNAorRNA鏈有極性二、RNAormRNA有二級(jí)結(jié)構(gòu)。tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)為三葉草，三級(jí)結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)-型，rRNA有二級(jí)結(jié)構(gòu)三、DNA1、modeldoublebelix2、DNA構(gòu)型3種〔1〕B-DNA即Watson-crickModel,右手螺旋，正常生理狀態(tài)時(shí)，DNA為B-DNA，DNA分子每繞一圈為10.4個(gè)bp〔2〕A-DNA右手螺旋，高鹽or脫水狀態(tài)時(shí)，DNA的構(gòu)型活體中DNA與RNAorRNA配對(duì)時(shí)為此種形式，DNA每繞一圈11個(gè)bp〔3〕Z-DNA左手螺旋，雙鏈中堿基平面與螺旋中軸不再成直角，Z-DNA每繞一圈為12bp，該構(gòu)型多集中于調(diào)控區(qū)與基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)3、DNA復(fù)制〔1〕互補(bǔ)復(fù)制〔2〕酶促反響〔dNTP、聚合酶、Mg2+〕〔3〕鏈的伸長(zhǎng)〔前導(dǎo)鏈、滯后鏈〕〔4〕DNA復(fù)制的起點(diǎn)與復(fù)制子：獨(dú)立復(fù)制的單位為復(fù)制子，高等生物為多復(fù)制子，原核生物為單復(fù)制子〔5〕合成時(shí)需要合成RNA引物，這是由于DNA 復(fù)制的DNA聚合酶不能開始新的DNA的合成，只能在RNA后面先參加一個(gè)堿基脫氧核苷酸第三節(jié)基因的組織與結(jié)構(gòu)基因組概念：對(duì)原核生物來講是它的整個(gè)染色體，對(duì)多倍體生物而言是指能維持配子or配子體正常功能的最低數(shù)目的一套染色體DNA序列分類重復(fù)序列是基因結(jié)構(gòu)的一個(gè)特點(diǎn)，根據(jù)重復(fù)序列可將DNA分為四類單一序列：在一個(gè)基因組中只有一個(gè)copy輕度重復(fù)序列：在一個(gè)基因組中有1-——20個(gè)copy中度重復(fù)序列：在一個(gè)基因組中有10——12萬個(gè)copy，對(duì)基因起調(diào)節(jié)作用，一般不編碼高度重復(fù)序列：在一個(gè)基因組中有幾百個(gè)——幾百萬個(gè)copy，有一些是rRNA和某些tRNA基因，大多為不編碼序列二、基因1909年，丹麥遺傳學(xué)家W.LJohonsson首先使用“gene〞這個(gè)詞，用來表達(dá)孟德爾的遺傳因子，后來又有順販子，操縱子等說法。概念：一個(gè)具有遺傳因子效應(yīng)的片段，是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，根據(jù)目前的認(rèn)識(shí)，基因應(yīng)該是能夠表達(dá)和產(chǎn)生基因產(chǎn)物〔pworRNA〕的核苷酸序列分類根據(jù)產(chǎn)物類型可分為蛋白質(zhì)基因和RNA基因根據(jù)產(chǎn)物功能可分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因編碼酶和不直接影響其他基因表達(dá)的prv調(diào)節(jié)基因阻遏蛋白和轉(zhuǎn)錄激活因子根據(jù)是否表達(dá)分外顯子和內(nèi)含子基因家族有些基因聚集在一起形成基因家族操縱子：原核生物中多基因聚集在一起形成的一種基因家族多基因家族：真核生物中多基因聚集在一起形成的一種基因家族，分簡(jiǎn)單基因家族和復(fù)雜基因家族。簡(jiǎn)單基因家族每個(gè)重復(fù)單元含有單一的轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)，包含的基因是一致的。復(fù)雜基因家族每個(gè)重復(fù)單元含有多個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)，包含的基因是相似的。轉(zhuǎn)座子：基因內(nèi)存在的可轉(zhuǎn)移的DNA片段能在同一細(xì)胞的不同染色體之間or同一染色體的不同位點(diǎn)之間轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移不依賴序列的同源性，且轉(zhuǎn)移的是一個(gè)新copy?；虻木?xì)結(jié)構(gòu)基因是遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，不能由交換分開，交換只能發(fā)生在基因之間，而不是之中?；蚴峭蛔儐挝唬夯蚩梢詮囊粋€(gè)等位形式變成另一等位形式，但其內(nèi)部沒有可以改變的最小單位?；蚴亲饔脝挝唬耗墚a(chǎn)生特定的表型效應(yīng)，基因的一局部不能起作用。如質(zhì)粒載體中插入的外源gene，使質(zhì)粒某基因失活。染色體是基因的載體：染色體的存在使等位gene可以有規(guī)那么別離，又可使非等位基因相互重組。三、遺傳密碼子：mRNA上編碼特定Aa的三個(gè)連續(xù)的核苷酸有64個(gè)，3個(gè)為終止密碼子。遺傳密碼具有的特性：〔1〕不重疊，即密碼子按三個(gè)一框讀下去〔2〕無逗號(hào)，連續(xù)翻譯各種Aa〔3〕起始密碼AUGorCUG〔4〕終止子UAG、UAA、UGA〔5〕兼并性：n個(gè)密碼子編碼同一Aa〔6〕通用性：但并非絕對(duì)通用，如在線粒體中UAG不為終止子，編碼Trp〔7〕可讀性：由起始密碼子到終止密碼子，編碼蛋白質(zhì)的一套密碼子四、基因表達(dá)Pro合成〔質(zhì)粒、Aa、能源、ATPorGTP〕TranscriptiontranslationReplicateDNA——————RNA——————proteinTrans-transcription合成模板mRNA真核生物中mRNA為核不均一RNA即hmRNA，通過加工，選擇性拼接而成成熟的mRNA〔即5’端帽，3’端尾，內(nèi)含子去除〕原核生物中的mRNA直接以DNA為模板，以堿基互補(bǔ)方式構(gòu)成，不經(jīng)加工，故RNA邊轉(zhuǎn)錄變翻譯?！捕尺\(yùn)輸機(jī)器tRNA將活化的AA〔氨基酸—tRNA〕根據(jù)密碼子要求運(yùn)輸。〔三〕裝配機(jī)器rRNA其大小亞基構(gòu)成一條容納mRNA的通道，多個(gè)rRNA可同時(shí)裝配一條多肽的合成?；蛲蛔兺蛔儯褐讣?xì)胞內(nèi)〔or病毒顆粒內(nèi)〕遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)or數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化。突變是工業(yè)Bac育種的根底，但也是菌種退化的主要原因。突變的分子機(jī)制基因符號(hào)如何表示野生型和突變型的表現(xiàn)型和基因型呢？這是基因符號(hào)的命名原那么和表示方法問題?；虻慕y(tǒng)一命名為：某個(gè)基因的名稱是根據(jù)該基因突變后的表現(xiàn)型效應(yīng)來命名的，所有基因型名稱均用三個(gè)小寫的斜體字母來表示，而其后的大寫斜體字母表示具體基因。所有的表現(xiàn)型均用三個(gè)正體的字母表示，其中首字母大寫。表現(xiàn)型：具有合成or利用某種物質(zhì)的能力，Sub+如Lac+〔利用乳糖〕缺乏合成or利用某種物質(zhì)的能力，Sub-如Lac-具有對(duì)某種抗生素的抗性，Antr如Strr具有對(duì)某種抗生素的敏感性，Ants如Strs基因型：能夠合成or利用某種物質(zhì)的野生基因型，sub+能夠合成or利用某種物質(zhì)的突變基因型，sub-突變的subA基因subA-subA基因的63號(hào)突變具有溫敏表型的subA基因突變每個(gè)基因座〔locus〕用斜體小寫的三個(gè)英文字母來表示，這三個(gè)字母取自表示這一基因的特性的一個(gè)or一組英文的前三個(gè)字母。如組氨酸基因用his〔histidine〕產(chǎn)生同一突變表型的不同基因，在三個(gè)小寫字母后用不同的一個(gè)大寫斜體字母來表示。如，色氨酸基因用trp表示，各個(gè)色氨酸基因用trpA、trpB等表示。同一基因的不同突變位點(diǎn)在基因符號(hào)后用阿拉伯?dāng)?shù)字表示。如trpA的不同位點(diǎn)突變分別用trpA23、trpA46等來表示。如果突變位點(diǎn)所屬的基因不確定，大寫字母用一連串自負(fù)代替。突變性的基因符號(hào)用基因座符號(hào)加上加號(hào)or其他符號(hào)來表示，例如在基因符號(hào)的右上角加“+〞or“—〞，表示該基因功能存在缺陷，而加“r〞or“s〞表示對(duì)某物質(zhì)的抗性和敏感性。基因表性和產(chǎn)物用相應(yīng)的基因型的正寫字母表示，其中第一個(gè)字母大寫。例如乳糖發(fā)酵缺陷型的符號(hào)是lacZ-，其表型符號(hào)為lacZ-。二、突變的分類1、按突變方式〔or突變發(fā)生原因〕：自發(fā)突變、誘發(fā)突變2、按變化范圍：染色體畸變、基因突變、基因重組與傳遞3、按表型：形態(tài)突變、生理生化突變、抗性突變、致病性突變?nèi)⒒蛲蛔儭簿屯蛔兊姆肿訖C(jī)制分析突變的原因〕1、堿基置換：轉(zhuǎn)換嘌呤or嘧啶之間的互換顛換嘌呤與嘧啶之間的互換2、移碼突變：由堿基插入or缺失引起的整個(gè)遺傳密碼子讀碼錯(cuò)誤。易位突變：DNA鏈上鄰近密碼子之間的堿基互換引起的突變or一個(gè)密碼子失去一個(gè)堿基，而另一個(gè)密碼子中又參加一個(gè)堿基造成堿基序列異常。四、染色體畸變指染色體結(jié)構(gòu)有較大范圍的變異1、缺失：指染色體去掉某一局部，該突變會(huì)造成遺傳平衡失調(diào)，故往往有害。2、重復(fù)：指染色體個(gè)別區(qū)段重復(fù)增加，通常由同源染色體的非等位交換引起的，對(duì)表型的影響有兩種情況?！?〕劑量效應(yīng)：即某一gene的copy數(shù)越多，表型效應(yīng)越顯著〔2〕位置效應(yīng)：指因重復(fù)區(qū)段位置的不同而影響基因間的相互關(guān)系，使表型出現(xiàn)差異。3、到位：正常染色體的某區(qū)段斷裂后，斷裂的片段倒轉(zhuǎn)180度，又重新連接，遺傳物質(zhì)沒有喪失，但基因序列發(fā)生變化有兩種形式，臂內(nèi)倒位和臂外倒位，倒位造成染色體局部節(jié)段的位置顛倒，極性相反。4、易位：染色體上一區(qū)段斷裂后，連接到另一條非同源染色體上的現(xiàn)象，有兩種情況〔1〕相互易位：即兩條非同源染色體之間相互發(fā)生局部交換〔2〕單向易位：即一條染色體的局部片段接到另一非同源染色體上。倒位和易位都無遺傳物質(zhì)交換，難出現(xiàn)新表型，但由于DNA損傷而隱形突變or死亡。染色體組變：由染色體數(shù)目發(fā)生變化而引起的變異。突變引起遺傳性狀變化一、突變引起的遺傳性狀的變化由堿基置換引起的變化有3種情況〔一〕同義突變和無義突變同義突變：DNA分子上的堿基變化引起密碼子形成新的密碼子。但這種密碼子編碼的Aa與原密碼子所構(gòu)成的Aa相同。如：CCU——CCC——CCA——CCG——prdine〔由于兼并性〕無義突變：突變后的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，稱為無義突變，〔UAG、UGA、UAA〕。通常在基因符號(hào)后面加寫〔Am〕、〔Oc〕or〔Opal〕分別表示琥珀型、赭石型、乳石型三種突變，使轉(zhuǎn)譯中途停止，難以完成一條完整的多肽鏈的合成，這種肽鏈無活性。錯(cuò)義突變：該突變引起Aa順序的變化，產(chǎn)生不同的生物表性。原因是由于堿基置換產(chǎn)生的密碼子與原來不同。如：CUA——GUA。使Leu——Val。移碼突變：由于通讀框的改變而引起的protein上Aa順序的改變〔非可信的堿基增加or減少〕改突變使多肽鏈上的Aa序列發(fā)生很大的改變，將出現(xiàn)明顯的遺傳性狀差異，最終引起性狀的變異，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致個(gè)體的死亡，如人類金銀KCNN3113——1140缺失引起移碼突變，可能引起精神分裂癥。二、突變型的種類：根據(jù)突變的表型效應(yīng)可分為以下幾種：〔一〕形態(tài)突變型：是一種可見突變，如菌落形態(tài)變化，細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞結(jié)果變化等?！捕成蛔冃裕哼@里指的是營(yíng)養(yǎng)缺陷型，糖類發(fā)酵突變株，色素形成突變株及有益代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力突變株。其實(shí)嚴(yán)格上講，所有的突變都?xì)w于生化突變。〔三〕條件致死突變：該突變?cè)谠试S條件下存活在限制條件下致死，用得最廣的是溫敏突變株。<1>熱敏突變株：eg.大腸桿菌的一種溫敏突變株在37C下正常生長(zhǎng)，在42C卻不能生長(zhǎng)。<2>冷敏突變株：對(duì)低溫敏感，具有比野生型高的最低生長(zhǎng)溫度溫敏突變的原因是突變基因的編碼產(chǎn)物對(duì)溫度的穩(wěn)定性降低，酶蛋白提高了對(duì)高溫或低溫的敏感性。<3>抑制敏感突變<脫敏突變>：在抑制基因存在時(shí)，能生長(zhǎng)繁殖，而抑制基因消失時(shí)，就停止生長(zhǎng)繁殖。如耐自身產(chǎn)物突變株〔抑制基因是抑制敏感物對(duì)菌體起作用〕<四>致死突變：由于基因突變而導(dǎo)致個(gè)體死亡的突變型叫致死突變型，通?？煞譃轱@性致死和隱形致死，雜合狀態(tài)的現(xiàn)行致死和純合狀態(tài)的隱形致死都能導(dǎo)致個(gè)體的死亡，而在單倍體中兩種類型都會(huì)導(dǎo)致個(gè)體的死亡，無法獲得突變體。<五>產(chǎn)量突變型：所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物明顯有別于原始菌株的突變株。產(chǎn)量高于原始菌株者為正突變菌株，反之為負(fù)突變株。產(chǎn)量突變型一般不易通過選擇性培養(yǎng)基被快速篩選出。是由于產(chǎn)量的上下往往是有多基因控制的。<六>抗性突變型：由于基因突變而產(chǎn)生的對(duì)某種化學(xué)藥物，致死因子或噬菌體具有抗性的變異菌株，突變前的菌株叫敏感型?？剐酝蛔冃桶顾幮酝蛔冃停故删w突變型，抗輻射突變型，抗高溫突變型，抗高濃度酒精突變型，抗高滲透壓突變型等。此類突變株往往可以通過在加有相應(yīng)藥物或物理因子處理的培養(yǎng)基上快速篩選出。細(xì)菌抗性的來源：1.突變2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移：細(xì)菌通過接觸而轉(zhuǎn)移產(chǎn)生抗性的質(zhì)粒3生理適應(yīng)：細(xì)菌因長(zhǎng)期接觸抗性因子而有暫時(shí)的抗藥性能，但基因不發(fā)生改變。特點(diǎn)：a離開抗性因子時(shí)抗性消失b群體細(xì)胞都具有同一特性。突變體的形成突變體的形成過程<一>.誘變劑在DNA接觸之前誘變劑：但凡能提高基因突變頻率的因素，誘變劑的種類很多，包括物理因素，化學(xué)因素。一種誘變劑不一定只能引起一種類型的突變，誘變劑必須通過細(xì)胞壁，細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)才能和DNA接觸。這個(gè)過程會(huì)引起一些化學(xué)反響，受到各種因素的影響，如亞硝酸使DNA和氨基酸脫氨。這些因素都會(huì)影響改變效果，許多生物的細(xì)胞對(duì)輻射的殺傷和誘變反響各不相同，這根本上取決了細(xì)胞外表對(duì)誘變劑的通透性。通透性越大，誘變?cè)饺菀?，誘變率越高。<二>突變發(fā)生過程：誘變劑與DNA接觸后是否發(fā)生突變，與DNA復(fù)制有關(guān)，而DNA復(fù)制到活潑程度與某些營(yíng)養(yǎng)條件和細(xì)胞的生理狀態(tài)有關(guān)。<三>突變體的形成：誘變劑和DNA接觸后，發(fā)生化學(xué)反響，繼而使得DNA上的堿基發(fā)生變化，產(chǎn)生突變，但突變到突變體的形成過程非常復(fù)雜，并不是所有的突變都形成突變株。當(dāng)一個(gè)突變發(fā)生后，要經(jīng)過復(fù)制才能形成突變體，在突變體前后過程中，生物細(xì)胞有一整套修復(fù)系統(tǒng)來修補(bǔ)還有一系列其他因素會(huì)可能使DNA結(jié)構(gòu)復(fù)原。DNA損傷：指任何一種不正常的DNA分子結(jié)構(gòu)，也稱為前突變。非標(biāo)準(zhǔn)堿基的堿基衍生物在DNA鏈中會(huì)存在非標(biāo)準(zhǔn)堿基和堿基的類似物。Eg尿嘧啶〔U〕能在DNA復(fù)制時(shí)滲入，C〔胞嘧啶〕，A能自發(fā)脫氧基尿嘧啶和次黃嘌呤，此外各種誘變劑可是堿基成為堿基衍生物，如3-甲基腺嘌呤，嘧啶二聚體6-氫-5，6-2羥胸腺嘧啶等。其中最常見的是T~T這種二聚體會(huì)造成雙螺旋局部變化氫鍵結(jié)合力顯著減弱，這種二聚體在復(fù)制時(shí)如果以它為模板，會(huì)將兩個(gè)腺嘌呤核苷酸加上去，但由于不能很好地形成氫鍵，會(huì)由3’-5’校對(duì)功能將之水解，而DNA復(fù)制毫無進(jìn)展，因而產(chǎn)生一個(gè)空耗的過程，即大量的dATP被分解，而DNA復(fù)制毫無進(jìn)展，由于DNA仍在不斷地合成，而DNA不能復(fù)制，細(xì)胞也不能分裂，這樣就出現(xiàn)細(xì)絲狀的蛇形細(xì)胞，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。堿基的喪失一般來說堿基的甲基化會(huì)破壞N-糖苷鍵。這樣會(huì)使堿基脫落，形成無嘧啶，無嘌呤堿基位點(diǎn)即〔AP位點(diǎn)〕。此外，細(xì)胞類的各種糖基化酶也能產(chǎn)生AP位點(diǎn)。烷基化損傷很多烷化劑能將DNA中的嘌呤堿基特別是鳥嘌呤烷基化。鏈的斷裂和交聯(lián)許多理化因子能引起DNA的單鏈斷裂和DNA的雙鏈斷裂尤其是電離輻射。〔X射線，快中子，r射線等〕，過氧化物，巰基化合物，某些金屬離子以及ＤＮＡ酶都能引起ＤＮＡ鏈的斷裂，某些抗生素，如絲裂霉素Ｃ和一些試劑如ＨＮＯ２能引起鏈內(nèi)堿基的交聯(lián)和鏈間堿基的交聯(lián)。２.ＤＮＡ的修復(fù)細(xì)胞中ＤＮＡ作為遺傳信息的載體，要求保持高度的精確性和完整性。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，生物體演化出了兩套系統(tǒng)來保障ＤＮＡ平安的修復(fù)。一套是糾正偶然的復(fù)制錯(cuò)誤的系統(tǒng)，另一套是修復(fù)體內(nèi)外化學(xué)物質(zhì)造成的ＤＮＡ分子損傷的系統(tǒng)。復(fù)制的修復(fù)ＤＮＡ聚合酶的校讀功能ＤＮＡ聚合酶的校對(duì)功能對(duì)于ＤＮＡ作為遺傳物質(zhì)所必需的穩(wěn)定性和極高的保真度至關(guān)重要。ＰＯＬ１和POL3都具有DNA聚合酶的活性，兩者都具有3’-5’核酸外切酶的活性。POL1主要用于DNA的修復(fù)和RNA引物的替換，ＰＯＬ３主要使ＤＮＡ鏈延長(zhǎng)。②.N-糖基酶修復(fù)系統(tǒng)對(duì)于DNA分子中的非標(biāo)準(zhǔn)堿基和堿基衍生物都是通過各自專一識(shí)別的N-糖基化酶來參與完成錯(cuò)誤的切除修復(fù)。這個(gè)系統(tǒng)包括N-糖基化酶AP限制性內(nèi)切酶，核酸外切酶，DNA聚合酶，ＤＮＡ連接酶。首先，在糖基化酶的作用下切開缺陷堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵，釋放缺陷堿基，形成一個(gè)AP位點(diǎn)，然后在AP核酸內(nèi)切酶作用下，將AP位點(diǎn)的磷酸二酯鍵翻開，去掉不帶堿基的磷酸脫氧核糖，最后在DNA聚合酶和連接酶作用下完成修復(fù)，〔US尿嘧啶-N-糖基酶系統(tǒng)為例〕此有圖未打出③錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)取出滲入DNA的堿基結(jié)構(gòu)類似物和錯(cuò)誤配對(duì)的堿基。DNA的錯(cuò)誤配對(duì)一般有DNAploymerase的3’-5’校對(duì)功能立即修復(fù)，但也有些特殊情況。沒有糾正而保存在DNA鏈上，這時(shí)錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行識(shí)別，糾正，該系統(tǒng)包括錯(cuò)配矯正酶，DNA聚合酶和DNA連接酶。矯正酶是一個(gè)酶系統(tǒng)。由于MutS,MutH,MutL三種蛋白構(gòu)成，這蛋白系統(tǒng)對(duì)錯(cuò)配位點(diǎn)識(shí)別并結(jié)合，形成復(fù)合物。DNA鏈通過該復(fù)合物雙向滑動(dòng)形成一個(gè)含有錯(cuò)配堿基在內(nèi)的DNA環(huán)，蛋白復(fù)合物中的MutH切割甲基化的附近鏈形成一個(gè)缺口，被切割的DNA鏈在核酸外切酶作用下從斷裂處開始朝錯(cuò)配位點(diǎn)進(jìn)行降解，然后在DNApolymerase作用下以親本鏈為模板合成新的DNA鏈?！?〕損傷修復(fù)P26①光修復(fù)研究得最早的修復(fù)系統(tǒng)是紫外損傷的修復(fù)，DNA經(jīng)UV照射后形成Ｔ－Ｔ光復(fù)活酶與之形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物暴露在可見光下，酶被活化并將Ｔ－Ｔ分解成單體，Ｅｎ被釋放。使ＤＮＡ鏈的缺口修復(fù)而恢復(fù)正常的ＤＮＡ雙鏈結(jié)構(gòu)。②切補(bǔ)修復(fù)〔復(fù)制前修復(fù)〕ａ．先切后補(bǔ)內(nèi)切酶作用－外切酶作用－聚合酶合成新的片段－連接酶連接ｂ．先補(bǔ)后切內(nèi)切酶作用－聚合酶作用－外切酶作用－連接酶連接③.重組修復(fù)〔復(fù)制后修復(fù)〕該修復(fù)只是使損傷的ＤＮＡ濃度相對(duì)變稀dsDNA-復(fù)制-重組-修復(fù)-產(chǎn)生兩條dsDNA重組修復(fù)是非常重要的修復(fù)機(jī)制，它不必向切除修復(fù)那樣需要等待很久后細(xì)胞的DNA才能復(fù)制，而是先復(fù)制在修復(fù)，重組修復(fù)還能修復(fù)某些不能被切除修復(fù)去除的損傷，比方某些損傷并不引起DNA雙螺旋的變形，但確定阻礙復(fù)制的進(jìn)行，但重組修復(fù)和正常的遺傳重組并不是完全一致的，在這個(gè)系統(tǒng)中最關(guān)鍵的基因是recA。RecA具有催化DNA分子之間的固源聯(lián)會(huì)和交換單鏈的功能。這個(gè)系統(tǒng)還需要recBCD基因，RecBRecCRecD是核酸外切酶V的亞基。RecA蛋白質(zhì)，它不但具有重組活性而且還有單鏈DNA結(jié)合活性以及由此產(chǎn)生的蛋白酶活性。正是這種蛋白酶活性誘發(fā)了許多基因特別是修復(fù)系統(tǒng)基因的表達(dá)，其中包括切除修復(fù)系統(tǒng)，重組修復(fù)系統(tǒng)和SOS修復(fù)系統(tǒng)。④SOS修復(fù)依賴于recA基因的表達(dá)，損傷沒有被轉(zhuǎn)移或修復(fù)而是被容忍從而保持復(fù)制DNA的完整性，被破壞的堿基往往失去特殊的配對(duì)性。SOS是一種旁路修復(fù)系統(tǒng)從能量來源來看以上各種修復(fù)系統(tǒng)中只有光修復(fù)利用光能，其余利用ATP水解釋放的能量，復(fù)制修復(fù)系統(tǒng)，光復(fù)活，切除修復(fù)，都是修復(fù)模板鏈，重組修復(fù)時(shí)形成一條新的模板鏈。ＳＯＳ修復(fù)是產(chǎn)生連續(xù)的子鏈，ＳＯＳ修復(fù)是唯一導(dǎo)致突變的修復(fù)，其余的修復(fù)機(jī)制是將損傷的ＤＮＡ恢復(fù)在到損傷前的狀態(tài)或者是產(chǎn)生于親本相同的子代ＤＮＡ。在誘變過程中，應(yīng)參加某些化學(xué)物質(zhì)抑制突變的ＤＮＡ修復(fù)，導(dǎo)致ＤＮＡ發(fā)生突變，如參加咖啡因，異煙肼，Ｔｒｐ后進(jìn)行ｕｖ照射３．幾個(gè)概念〔１〕正向突變回復(fù)突變和一致突變從突變的效應(yīng)背離或返回野生型兩種方向來講可分為正向突變和回復(fù)突變正向突變：指改變了野生型形狀的突變回復(fù)突變：使突變體所失去的野生型形狀得以恢復(fù)的突變抑制突變：一個(gè)位點(diǎn)的突變抑制了另一個(gè)突變位點(diǎn)的表型效應(yīng)使其回到野生型，該突變稱為抑制突變。突變不是原位點(diǎn)回復(fù)突變而是第二位點(diǎn)突變?cè)稽c(diǎn)的突變依然存在１.基因內(nèi)抑制突變：抑制發(fā)生在正向突變的基因中兩種情況２.基因間抑制突變：抑制發(fā)生在其他基因中增變基因和突變熱點(diǎn)增變基因：一與一基因的突變可以使整個(gè)基因組的突變率增高時(shí)，該基因?yàn)樵鲎兓?。如：ＤＮＡ聚合酶的３＇－５＇校?duì)功能喪失或降低那么使突變率上升。ｒｅｃＡ基因突變。突變熱點(diǎn)：突變頻率高于平均數(shù)的位點(diǎn)稱為突變熱點(diǎn)，從理論上講ＤＮＡ分子上每一堿基都能發(fā)生突變，但實(shí)際上突變位點(diǎn)并非完全隨機(jī)分布，DNA分子上的各局部有著不同的突變率。前面講的修復(fù)系統(tǒng)似乎能修復(fù)一切損傷，然而實(shí)際上當(dāng)射線或化學(xué)物質(zhì)作用是，還是會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡。原因：1、DNA產(chǎn)生了不可修復(fù)的損傷，如射線引起DNA雙鏈在同一點(diǎn)斷裂；2、修復(fù)系統(tǒng)本身受到損傷;3、修復(fù)系統(tǒng)被飽和，修復(fù)不了大量的損傷；4、修復(fù)引起的突變導(dǎo)致所產(chǎn)生的對(duì)細(xì)胞生存所必需的產(chǎn)物沒有活性。二、突變的表型效應(yīng)〔從突變到突變表型〕突變?cè)斐蛇z傳性狀改變，可能引起表型的變化，但并非所有突變都能產(chǎn)生此種效果，突變能否產(chǎn)生表型效應(yīng)有以下幾種情況：〔一〕突變不改變遺傳性狀，不引起表性效應(yīng)；原因:同義突變，無義突變，沉默突變：新合成的Aa不是多肽的主要Aa；〔二〕顯性突變和隱形突變的表型效應(yīng)1、二倍體中純合體的隱形等位基因〔aa型〕，顯性或隱形突變都會(huì)引起表型效應(yīng)，雜合體和純合體的顯性基因(即AA型)，只有顯性突變才引起表型改變；2、單倍體中不管顯性或隱形突變都會(huì)出現(xiàn)表型變化〔三〕突變的表型與環(huán)境1、環(huán)境的選擇作用?；蛲蛔儠?huì)是細(xì)胞內(nèi)原有的協(xié)調(diào)關(guān)系打亂，這種由突變而形成的新個(gè)體對(duì)原有的環(huán)境適應(yīng)能力降低，故可能被環(huán)境淘汰，需調(diào)節(jié)適應(yīng)它生長(zhǎng)的環(huán)境；2、環(huán)境造就表型：在不同的環(huán)境下，微生物的基因型不發(fā)生變化，如菌株在不同的環(huán)境中的產(chǎn)抗水平不同，故對(duì)于突變株應(yīng)提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境；3、有些微生物突變后的表形隨環(huán)境的變化而變化，如脈胞菌在有光照下為紅色，反之為白色。綜上所述：表型是基因型〔內(nèi)因〕和環(huán)境綜合作用的表現(xiàn)。四、表現(xiàn)延遲：突變產(chǎn)生的新的基因型個(gè)體能表現(xiàn)出來的遺傳特性在當(dāng)代出現(xiàn)，其表型的出現(xiàn)必須經(jīng)過兩代以上的繁殖復(fù)制。原因：1、誘變劑的路程效應(yīng)，誘變劑引起DNA改變的時(shí)間落后于細(xì)菌當(dāng)代繁殖的時(shí)間，誘變劑進(jìn)入細(xì)胞的速度相當(dāng)慢2、突變一般為隱性的突變，如果轉(zhuǎn)移核細(xì)胞中所形成的是雜核細(xì)胞，隱性基因的表型只有經(jīng)過細(xì)胞的幾代繁殖，與細(xì)胞所有核都是含有突變基因時(shí)〔即核突變時(shí)〕才能表達(dá)出來，《別離性表現(xiàn)延遲》3、原有基因產(chǎn)物的影響，與基因發(fā)生突變后，細(xì)胞雖失去了產(chǎn)生這種功能的能力，但是原來堆積在細(xì)胞中的功能產(chǎn)物支撐其后代野生型的作用，突變型只有與原有的基因產(chǎn)物在子細(xì)胞的濃度逐漸隨分裂稀釋到最低限度才能出現(xiàn)。五、基因突變的規(guī)律所有的生物在遺傳變異特征上都遵循著共同的規(guī)律，基因不管發(fā)生什么生物中也不管其突變帶來的遺傳信息改變的性質(zhì)是什么，都符合同樣的規(guī)律。1、基因突變的自發(fā)性突變可自發(fā)，抗性的發(fā)生與所抗因子的存在與否無關(guān)。如微生物抗藥性的產(chǎn)生不是由于藥物引起的。波動(dòng)實(shí)驗(yàn)P23該實(shí)驗(yàn)說明，E.coli抗噬菌體抗性的突變不是由所抗的環(huán)境噬菌體誘導(dǎo)出來的。而是在它接受噬菌體前，這一突變發(fā)生得越早，那么抗性菌落出現(xiàn)得越多，反之那么越少。噬菌體只是起淘汰原始的未突變的敏感株的作用。影印實(shí)驗(yàn)由圖可知，在三號(hào)培養(yǎng)皿中長(zhǎng)出的抗鏈霉素菌落可在沒有接觸鏈霉素的2號(hào)平板中找到。并通過挑選抗性菌落，接種，涂布培養(yǎng)，重新接種影印培養(yǎng)等一系列過程使可獲得大量的抗鏈霉素突變株。實(shí)驗(yàn)說明改抗性是在沒有接觸藥物之前就存在的，是自發(fā)的，與鏈霉素的存在與否無關(guān)。鏈霉素只是起到了鑒別和篩選抗性菌株的作用。2、基因突變的隨機(jī)性波動(dòng)實(shí)驗(yàn)還說明了突變具有隨機(jī)性，突變發(fā)生的時(shí)間是隨機(jī)的。否那么甲組中各個(gè)小管間抗性菌落的數(shù)目不會(huì)有那么大的差異。突變的個(gè)體時(shí)間和基因都是隨機(jī)的，也就是說在一個(gè)Bac群體中，對(duì)于cell而言，哪個(gè)cell將發(fā)生突變是隨機(jī)的，且一個(gè)cell的突變不僅在時(shí)間和個(gè)體上上是隨機(jī)的，而且在DNA的哪個(gè)位點(diǎn)發(fā)生也是隨機(jī)的。但隨機(jī)性并非說突變是沒有原因或是不可知的。突變這一偶然事件的必然性表現(xiàn)在特定的突變率上，也就是說，突變總是以一定的頻率在群體中發(fā)生?！驳獶NA分子中各個(gè)部位有著不同的突變頻率，存在突變熱點(diǎn)?！?、稀有性指在正常情況下，突變發(fā)生的頻率往往很低，一般10-6.突變率：即在一個(gè)世代或其他規(guī)定的單位時(shí)間內(nèi)，在特定的環(huán)境條件下，一個(gè)細(xì)胞發(fā)生某一次性狀突變的概率，但基因中存在增變基因。4、基因突變的穩(wěn)定性，即可遺傳性突變是穩(wěn)定的，一旦產(chǎn)生就能穩(wěn)定的遺傳，不會(huì)因抗性的消失而消失。5、獨(dú)立性突變的發(fā)生具有獨(dú)立性。在一個(gè)Bac群中，一個(gè)cell的突變與其他個(gè)體之間互不相關(guān)，并且某一個(gè)基因的突變和另一個(gè)基因的突變之間也是互不相關(guān)的。兩個(gè)不同基因同時(shí)發(fā)生突變的頻率為兩個(gè)基因各自的突變率的乘積。交叉抗性：指細(xì)菌對(duì)兩種抗生素等藥物同時(shí)由敏感變?yōu)榭剐?。似乎與獨(dú)立性相矛盾，其實(shí)不然，這主要是由于細(xì)胞內(nèi)單一基因的突變導(dǎo)致Bac對(duì)結(jié)構(gòu)類似或作用機(jī)制類似的抗生素均有抗性，從而表現(xiàn)為交叉抗性。6、可逆性：突變基因可通過再次突變回復(fù)到野生型，回復(fù)率同樣很低。7、誘導(dǎo)性：突變頻率可以通過某些理化因素的處理而大大提高，一般10——10的五次方倍。第五章工業(yè)Bac誘變育種劑誘變劑種類：物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變劑第一節(jié)物理誘變劑物理誘變劑又稱為輻射，有非電離輻射類的紫外線，激光和離子束等。電子輻射類的X射線、R射線和快中子等。常用的有UV和R射線。一，物理誘變劑的生理學(xué)效應(yīng)1.、輻射作用的原理：高能輻射UV熱能導(dǎo)致生物系統(tǒng)損傷，繼而發(fā)生遺傳變異其變異率和死亡率與輻射劑量和人熱能劑量有一定的相關(guān)性，一般來講DSDNA斷裂或SSDNA斷裂。以SSDNA斷裂居多。電離輻射引起基因突變和染色體畸變，非電離輻射主要形成T~T2作用過程：P35。圖4.1輻射的過程可分為物理、物理_化學(xué)、化學(xué)和生物等幾個(gè)階段。當(dāng)輻射處理生物細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞首先接受能量，穿過CELLwall.Cellmemberance和DNA接觸，產(chǎn)生一系列的化學(xué)變化從而使DNA發(fā)生改變，產(chǎn)生變異形成突變體。二．影響輻射生物效應(yīng)的因素輻射引起生物效應(yīng)的強(qiáng)弱，即取決于BAC內(nèi)遺傳因素，也受環(huán)境的影響。BAC的遺傳背景:品系不同，對(duì)輻射的敏感不同，如AT含量越高，對(duì)ＵＶ越敏感。但對(duì)電離輻射時(shí)那么相反。ＢＡＣ生理狀態(tài)：如孢子、芽孢、菌絲體對(duì)誘變的敏感不同，主要是由于Cellwall和它以外的結(jié)構(gòu)對(duì)誘變劑的影響可見光：可消除UV的誘變效應(yīng)水分：H2O能有助于產(chǎn)生自由基。故含水量低的Cell敏感性降低T.最適生長(zhǎng)溫度內(nèi)。溫度能增強(qiáng)輻射效應(yīng)1：促進(jìn)O2與自由基之間的反響2：加快反響速度O2、O2對(duì)電離輻射效應(yīng)影響校大。O2充足、誘變效果好。由于O2能產(chǎn)生氧自由基三、非電離輻射——UV〔一〕誘變機(jī)制主要是由于它引起DNA變化造成的DNA強(qiáng)烈吸收紫外線1．ＤＮＡ鏈的斷裂。2．DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)3．核酸與蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)。4．Ｃ與Ｕ之間的水合作用５．嘧啶二聚體。其中絕大多數(shù)為Ｔ＝Ｔ。但也有Ｔ＝Ｃ和Ｃ＝Ｃ二聚體通常Ｔ＝Ｔ是DNA鏈上相鄰的嘧啶之間交聯(lián)而成的，二聚體形成后破壞A的正常參入復(fù)制在這一點(diǎn)上突然停止或錯(cuò)誤進(jìn)行以至在心形成的鏈上有一個(gè)改變了的堿基序列?！捕矰NA損傷修復(fù)。1。共修復(fù)。2。切補(bǔ)修復(fù)。3。SOS修復(fù)5。DNA聚合酶的校正作用〔二〕紫外誘變1.誘變的有效光譜。200-300nm最有效的為2537A。15Ｗ紫外燈。３０Ｗ殺菌。2.誘變的輻射劑量〔1〕絕對(duì)劑量org/mm2(2)相對(duì)劑量a照射時(shí)間，在固定燈的燈率和燈管距離的情況下，照射劑量的大小與照射時(shí)間成正比關(guān)系照射時(shí)間長(zhǎng)劑量大b.殺菌率。一般認(rèn)為90%——99%3.誘變的步軸與方法〔1〕出發(fā)株活化。細(xì)菌——對(duì)數(shù)期。霉菌的放線菌——孢子剛成熟期使其處于最正確生理狀態(tài)。對(duì)誘變劑敏感同時(shí)生存能力強(qiáng)〔2〕預(yù)培養(yǎng)?；钅艿木辍臃N到含有抑制劑DNA修復(fù)的物質(zhì)〔或進(jìn)同步培養(yǎng)〕〔3〕制備懸浮液。菌液——離化——生理鹽水混勻——單細(xì)胞懸液〔4〕紫外照射〔5〕后代培養(yǎng)〔6〕稀釋涂皿，別離純化〔篩選〕〔四〕提高突變率的方法〔1〕誘變后馬上涂布培養(yǎng)減少?gòu)?fù)制前修復(fù)?！?〕添加修復(fù)抑制劑：如參加異煙腫。Trp酪素水解物等氧化性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)〔3〕誘變層馬上放入暗處，防止光復(fù)活，但將培養(yǎng)物放入非生長(zhǎng)條件下的暗處也會(huì)是致死率和突變率下降，這稱為液體保存復(fù)活或暗修復(fù)。〔4〕誘變后，進(jìn)入冰水中1-2小時(shí)。抑制修復(fù)酶的活性四.電離輻射1.作用原理：其高能量和穿透力可使H2O或其他一些分子電離而產(chǎn)生含有未配對(duì)電子的分解碎片。這些碎片能打斷DNA鏈，并改變嘌呤和嘧啶堿基；當(dāng)然，電離輻射對(duì)DNA的作用還未得出較完整的概念。X射線和V射線是電子流。光子是不帶電的。故它不直接引起物質(zhì)電離，只有與原子或分子碰撞時(shí)，把能量傳遞給原子而產(chǎn)生次級(jí)電子。這些次電子一般具有很高的能量。直接或間接改變ＤＮＡ結(jié)構(gòu)，直接效應(yīng)是造成ＤＮＡ斷裂。間接效應(yīng)是電離輻射從水或有機(jī)分子產(chǎn)生自由基。自由子作用于分子。２．種類：Ｘ射線、Ｒ射線、快中子、Ｂ粒子、ａ粒子３．電離輻射的劑量?？熘凶佑胷ad表示。1radorg被照射物質(zhì)吸收100org輻射能量的射線劑量。X射線和R射線用倫琴〔R〕表示，即1cm2枯燥空氣在0攝氏度，1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下產(chǎn)生2.08X10〔9〕離子所需的能量。4.電離輻射的照射方法。1.直接對(duì)菌落照射。2.制備菌落懸液五.新型物理誘變劑1.微波：微波有熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)我們希望的是非熱效應(yīng)，在輻射過程中采用分散低溫枯燥法。消除其熱效應(yīng)2.紅外線。作用機(jī)制目前不明確。主要與UV聯(lián)用?？商岣咄蛔兟?.激光激光視一種光量子流，可以通過閃、熱、壓力、和電磁場(chǎng)效應(yīng)的綜合作用。直接或間接地影響生物體引起DNA發(fā)生變化。4.高能電子流：是較強(qiáng)的電離輻射，誘變劑量一般為90%——99%殺菌率5.離子注入離子注入的技術(shù)原理是用能量為100Kev量級(jí)的電子束入射到材料中去離子束與材料中的原子或分子將發(fā)生一系列物理和化學(xué)的相互作用，入射離子逐漸損失能量，最后停留雜材料中。并引起材料外表成分。結(jié)構(gòu)和性能發(fā)生變化，從而優(yōu)化材料外表性能，或獲得某些新的優(yōu)異性能。優(yōu)點(diǎn)：1、不但有能量沉積，而且還有質(zhì)量沉積〔即：既能產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，又能生成新的分子〕。故可與生物體作用得到高的突變率且突變譜廣。死亡率低正突變率高。2、離子注入通過不同電荷數(shù)、質(zhì)量數(shù)、能量和劑量的組合。可提供眾多的誘變條件。這些電、質(zhì)/、能的聯(lián)合作用，可強(qiáng)烈影響生物體的生理生化特征，并引起基因突變。3、具有作用區(qū)域的選擇性。種類的多樣性。其作用是局部的可對(duì)生物體實(shí)行定點(diǎn)區(qū)域誘變4、存效、方便、平安無污染第二節(jié)化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑：一類對(duì)ＤＮＡ起作用。改變其結(jié)構(gòu)。并引起遺傳變異的化學(xué)物質(zhì)根據(jù)作用方式可分為堿基類似物，移碼突變劑，堿基修飾劑〔烷化劑、脫氧劑、羥化劑〕和其他種類劑量的控制主要取決于濃度和作用時(shí)間堿基類似物：指和DNA結(jié)構(gòu)中天然的嘧啶、嘌呤四種堿基在分子結(jié)構(gòu)上相似餓一類物質(zhì)如5-BUT的結(jié)構(gòu)類似物。2-AP是Ａ的結(jié)構(gòu)類似物在ＤＮＡ復(fù)制時(shí)，它們可以被錯(cuò)誤的摻入到ＤＮＡ中。引起誘變效應(yīng)?！惨弧痴T變機(jī)制堿基類似物的誘變機(jī)制是通過互變異構(gòu)表達(dá)象實(shí)現(xiàn)的以５－ＢＵ為例加以說明〔Ｐ４３〕嘧啶具有酮式和稀醇式。嘌呤具有氧基狀態(tài)和亞氨基狀態(tài)。5-BU代替T參加到ＤＮＡ中。酮式與A配對(duì)。稀醇式與G配對(duì)引起正突變的機(jī)制〔正常摻入。錯(cuò)誤復(fù)制〕？？？、、——Ａ＝ＴA=T——A=T——A=BU——第二次復(fù)制G〔三橫〕C——第一次復(fù)制BU〔三橫〕G〔稀醇式〕——A-BU引起四復(fù)制突變的機(jī)制〔錯(cuò)誤摻入，正常復(fù)制〕5—BU摻入——G〔三橫〕CG〔三橫〕C————G〔三橫〕C——G〔三橫〕Bu——第一次復(fù)制——A=T——A—BU————A=BU注意：只有多Cell中缺少T時(shí)，BU才可以取代T摻入故培養(yǎng)時(shí)去T才能引起突變又如2—AP。能與T配對(duì)形成T=AP。會(huì)與C配對(duì)引起A=T——G=C突變圖略堿基類似物必須經(jīng)過兩代以上繁殖才能表現(xiàn)出來且引起的誘變是通過DNA復(fù)制來實(shí)現(xiàn)的。所以它只對(duì)正在新城代謝和繁殖的Bac起作用。對(duì)休眠CeLL和脫離菌體無作用?！捕硥A基類似物的誘變處理方法1.單獨(dú)處理出發(fā)株活化——培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期——洗滌饑餓培養(yǎng)〔消耗體內(nèi)貯存的物質(zhì)〕——參加堿基類似物質(zhì)——后培養(yǎng)——篩選2．與輻射線復(fù)合處理。參加堿基類似物以后，參加一些DＮＡ修復(fù)抑制劑培養(yǎng)一定的時(shí)間使其滲入到ＣｅＬＬ中。再用輻射線處理后，將其培養(yǎng)二．堿基修飾劑〔一〕烷代劑具有一個(gè)或多個(gè)活性烷基，此烷基能轉(zhuǎn)移到其他分子中。易取代DNA中的活潑H原子，直接與一個(gè)或多個(gè)堿基及磷酸局部反響，使其被烷化。從而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，使DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基錯(cuò)配而引起突變。堿基中最容易發(fā)生活化的是嘌呤類，其中鳥嘌呤NT是最易引起反響的位點(diǎn)，烷化劑有單功能的如亞硝基類、磺酸脂類、硫酸酯類重氮烷類和乙烯亞胺類。雙功能烷化劑那么有硫薺子類，多功能指烷化劑帶三個(gè)以上的活性烷基1、作用規(guī)律〔1〕雙功能的或多功能烷化劑毒性大致死率高、誘變效果差。此種烷化劑除了有單功能的烷化劑的作用外很容易引起交聯(lián)反響使ＤＮＡ斷裂〔2〕大基因的烷化劑的反響速度比小基團(tuán)的要快，毒性大，死亡率高，誘變效果差。如，乙基烷化劑比甲基烷化劑的效果差。2、烷化劑的作用機(jī)制烷化劑的誘變機(jī)制比擬復(fù)雜，有的還未完全弄清但是堿基轉(zhuǎn)換引起錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)造成基因的主要原因1.的錯(cuò)誤配對(duì)。如G數(shù)易受到烷化作用形成T—烷基鳥嘌呤，并與錯(cuò)誤配對(duì)。使GC轉(zhuǎn)為AT如T被烷化后使AT轉(zhuǎn)化GC2.引起ＤＮＡ分子中磷酸和糖之間的共價(jià)鏈發(fā)生斷裂。發(fā)生脫堿基作用，形成AP位點(diǎn)這種位點(diǎn)一般被N—糖基酶修復(fù)系統(tǒng)。但沒有被修復(fù)的會(huì)采用SOS修復(fù)這樣就帶來了突變3．是兩個(gè)G的N個(gè)位點(diǎn)形成共價(jià)鍵。形成G_G4．一般雙功能烷化劑易引起ＤＮＡ雙鏈間的交聯(lián)，形成變異或死亡５．可能造成染色體畸變3、烷化劑的性質(zhì)：活潑不大穩(wěn)定，水溶液中易水解，大局部烷化劑的半衰期短且其長(zhǎng)短與Ｔ、ＰＨ有關(guān)。常用的有亞硝基胍〔ＮＴＧ〕。甲基磺酸乙脂〔EMS〕硫酸二乙酯〔PES〕乙烯亞胺氮薺體。NTG或NG理化性質(zhì)：不溶于水。黃色晶狀物質(zhì)。見光分解誘變性質(zhì):起誘變劑。使Cell發(fā)生一次或?qū)掖瓮蛔兓蚴苟嗷虿l(fā)多為作用于營(yíng)養(yǎng)缺陷性誘變誘變機(jī)制PH<5.5時(shí)NG——HNO3PH>7.8時(shí)NG——CH2N2PH=6NG本身與DNA發(fā)生烷化反響誘變方法A、菌懸浮液法菌株活化——菌懸浮液+NG——保濕生長(zhǎng)——終止反響——后培養(yǎng)——?jiǎng)e離終止方a冷的生理鹽水稀釋b低溫離心洗滌B、搖勻振蕩處理：菌株活化——液體培養(yǎng)至最正確狀態(tài)——DNA和乳化劑——后培養(yǎng)——?jiǎng)e離C、平面生長(zhǎng)處理——菌種活化——接種到NG平板上——后培養(yǎng)其他的烷化劑〔自學(xué)0〔二〕脫氧劑亞硝酸HNO2是典型的脫氧劑?！?〕誘變機(jī)制：堿基脫氧但凡含有NH2的堿基〔AGC〕都能被HNO2作用產(chǎn)生氧化脫氨反響是—NH2基團(tuán)變成酮基改變配對(duì)性質(zhì)，造成堿基轉(zhuǎn)換突變Ａ——H次黃嘌呤H與Ｃ配對(duì)使AT——ＧＣＣ——UＵ與A配對(duì)使ＧＣ——ＡＴＧ——Ｘ黃嘌呤Ｘ與G配對(duì)不發(fā)生轉(zhuǎn)換〔2〕使DNA兩條鏈之間發(fā)生交聯(lián)作用，阻礙雙鏈的分開，從而影響DNA復(fù)制引起確實(shí)突變〔3〕處理方法菌懸液〔孢子懸液〕——NAＮＯ２＋醋酸ｂｕｆｆｅｒ——保溫突變——參加PH8NA2HPO4溶液ＰＨ至６．８終止反響——后培養(yǎng)——稀釋別離〔三〕羥化劑羥氨是一種典型的羥化劑具有特異誘變效應(yīng)能專一性誘發(fā)ＧＣ——AT的轉(zhuǎn)換。對(duì)噬菌體及離體ＤＮＡ專一性更強(qiáng)誘變機(jī)制與PH和濃度有關(guān)PH6.0專一性與C反響使C羥化后與Ａ配對(duì)引起ＧＣ——ＡＴ轉(zhuǎn)換濃度０．１-1MPH９．０與U反響使其羥化〔翻譯過程中受損0濃度10的付三次方PH9.0其產(chǎn)物與ＴＧ反響引起其羥化與Ｃｅｌｌ中其他物質(zhì)作用產(chǎn)生H2O2t通過H2O2引起突變〔四〕移碼突變劑移碼突變劑是一類能夠嵌入到ＤＮＡ分子中的物質(zhì)如吖啶類化合物，主要用于質(zhì)粒的脫落包括元黃素吖啶黃素；溴化乙錠和一系列ＩＣＲ類化合物〔一類由烷化劑〕和吖啶類結(jié)合而形成的化合物。誘變機(jī)制：移碼突變劑嵌入到DNA分子中，使相鄰的兩個(gè)堿基之間距離拉寬，迫使DNA分子的長(zhǎng)度增加。復(fù)制過程中隨著雙螺旋伸展或解開一定的長(zhǎng)度造成閱讀框的滑動(dòng)，由于子代DNA分子上減少或增加一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基，假設(shè)增減的堿基數(shù)缺乏3的倍數(shù)，就會(huì)引起密碼轉(zhuǎn)錄翻譯錯(cuò)誤，導(dǎo)致移碼突變。移碼誘變的嵌入并不導(dǎo)致突變，必須通過DNA的復(fù)制才能形成突變，是一種低效誘變劑，誘變方法可以是平皿生長(zhǎng)法或液體培養(yǎng)法，即在培養(yǎng)基中參加誘變劑培養(yǎng)：〔五〕、金屬鹽類Licl、Alcl3、Mgso4、但一般為助誘變劑〔六〕、其他誘變劑1、秋水仙堿：多倍體誘變劑，破壞紡錘體形成。2、抗生素、絲霉素、鏈黑霉素等，但一般與其他誘變劑聯(lián)用第三節(jié)生物誘變劑噬菌體：一般是溶源性的，引起抗噬菌體突變株的出現(xiàn)?；蛘T變劑：用特定的核苷酸序列作介導(dǎo)，將有精確的點(diǎn)突變的核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，使之在一定的條件下引起基因突變，該特定的帶有突變位點(diǎn)的核苷酸叫做基因誘變劑。局限性：只能對(duì)天然蛋白質(zhì)的某些Aa進(jìn)行替換，而高級(jí)結(jié)構(gòu)根本不變，因此對(duì)基因的改造非常有限。種類：按誘變方式目前可以分為以下幾類轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)突變劑2、轉(zhuǎn)化誘發(fā)突變劑3、轉(zhuǎn)座誘發(fā)突變劑工業(yè)Bac產(chǎn)生菌的別離篩選菌種的來源：1、購(gòu)置2、自然別離篩選3、從發(fā)酵產(chǎn)品中別離篩選工業(yè)Bac篩選包括：1、從自然界中別離所需菌體2、把得到的菌進(jìn)行別離純化，并進(jìn)行子代產(chǎn)物鑒別。步驟：一般為采樣——富集——?jiǎng)e離——篩選——性能鑒定含Bac樣品的采集在采集Bac樣品是，要遵循的一個(gè)原那么是：材料來源越廣泛，就越有可能獲得新的菌種。從土壤中采樣土壤中Bac含量規(guī)律：細(xì)菌＞放線菌＞霉菌＞酵母＞藻類＞原生動(dòng)物細(xì)菌〔十的八次方每克〕、放線菌〔十的七次方每克〕、霉菌〔十的六次方每克〕、酵母〔十的五次方每克〕、藻類〔十的一次方每克〕、原生動(dòng)物〔十的負(fù)一次方每克〕根據(jù)土壤特點(diǎn)土壤有機(jī)質(zhì)和通氣狀況①森林土適合霉菌、酵母；②耕作土通氣良好，有機(jī)質(zhì)豐富，適宜放線菌、細(xì)菌。土壤PH和植被狀況①：PH7.0—7.5放線菌、細(xì)菌；②：PH＜7.0霉菌、酵母。3、地理?xiàng)l件：南方＞北方4、季節(jié)條件：南方秋季5、采樣方法：5—25cm處的土樣北方10—30cm二、根據(jù)Bac的生理特點(diǎn)采樣1、根據(jù)Bac的營(yíng)養(yǎng)類型：面粉廣含淀粉適合利用淀粉作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的淀粉酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)。森林中含有纖維素，適合利用纖維素作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的纖維酶產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)。2、根據(jù)Bac的生理特點(diǎn)：如高溫酶產(chǎn)生菌、低溫酶產(chǎn)生菌、耐壓菌的采樣等。第二節(jié)．含Bac樣品的富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)：根據(jù)Bac生理特點(diǎn)，創(chuàng)造最適的生長(zhǎng)環(huán)境，使目的Bac迅速生長(zhǎng)繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌種，又稱施壓培養(yǎng)，主要是根據(jù)C,N,pH,T,O2等生理?xiàng)l件的控制。一、控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分。常用的有三種方法1、人為地參加相應(yīng)的底物作為唯一C或N源，哪些能快速分解利用該C,N源的菌得到充足的營(yíng)養(yǎng)而迅速生長(zhǎng)。其他菌受到生長(zhǎng)限制，要注意的是能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的Bac不是單一的菌落，而是營(yíng)養(yǎng)類型相同的菌群，如在培養(yǎng)基參加淀粉作為唯一C源，篩選淀粉酶產(chǎn)生菌。2、根據(jù)Bac不同種類選用相應(yīng)的富集培養(yǎng)基，如淀粉瓊脂培養(yǎng)基常用于絲狀菌的增殖。3、對(duì)于用于降解污染物的環(huán)保菌的別離，可用參加污染物作為唯一C，N源的方法的連續(xù)培養(yǎng)基?？刂婆囵B(yǎng)條件，主要是對(duì)pH，T,O2等一些條件的特殊要求加以控制。抑制不需要的菌種，通過高溫，高壓，參加抗生素等方法減少非目的菌種的數(shù)量。如別離芽孢桿菌時(shí)，先在80度下加熱20分鐘或50%的乙醇浸泡一小時(shí)，殺死營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞。別離孢子時(shí)，先在50度下加熱20分鐘或50%的乙醇浸泡一小時(shí)，殺死營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞。別離霉菌時(shí)，參加四環(huán)素來抑制細(xì)菌。別離放線菌時(shí)，參加青霉素〔抑制G+〕，鏈霉素〔抑制G-〕，制霉素〔抑制霉菌〕。第三節(jié)Bac別離富集后的培養(yǎng)基仍然有多種Bac混雜在一起，即使占了優(yōu)勢(shì)的類Bac，也并非純種。好氧菌Bac的別離別離方法的分類1.菌落純2.細(xì)胞純稀釋涂布法得到單菌落的時(shí)機(jī)大劃線別離法該法操作簡(jiǎn)單，效果較好利用平皿的生化反響進(jìn)行別離根據(jù)Bac特殊的生理特性，或利用給某些代謝產(chǎn)物的生化反響來別離目的菌?？娠@著提高菌株的別離純化的效率1：透明圈法用于別離水解酶產(chǎn)生菌，在培養(yǎng)基中〔平板培養(yǎng)基〕參加溶解性差的底物使培養(yǎng)基渾濁，能分解底物的Bac便會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反響了該菌株利用底物的能力。如別離脂肪酶，淀粉酶，蛋白酶，核酸酶產(chǎn)生菌。2：變色圈法對(duì)于不易產(chǎn)生透明圈的產(chǎn)生菌，可在底物平板中參加指示劑或顯色劑，主要利用指示劑或顯色劑的選擇反響。如果膠酶產(chǎn)生菌——?jiǎng)偣t〔變成絳紅色〕，谷氨酸產(chǎn)生菌——溴百里酚〔pH<6.2黃色，pH>7.6藍(lán)色〕，脂肪產(chǎn)生菌——尼羅藍(lán)〔以吐溫為底物，咖啡色——藍(lán)紫色〕，脂肪產(chǎn)生菌——維多利亞藍(lán)〔起初培養(yǎng)基中性，粉紅——藍(lán)；起初培養(yǎng)基堿性，咖啡色——藍(lán)綠色〕3:生長(zhǎng)圈法用于別離篩選氨基酸，核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌，要與工具菌一起涂布，工具菌是一些相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，目的Bac周圍會(huì)有工具菌的生長(zhǎng)。4：抑菌圈法用于抗生素產(chǎn)生菌的篩選，也要與工具菌一起涂布培養(yǎng)工具菌是對(duì)抗生素相應(yīng)的敏感菌，目的Bac周圍無工具菌的生長(zhǎng)?！菜摹辰M織別離法從一些病變或特殊組織中別離菌株的方法1、對(duì)一般病變組織的別離方法切除小塊含菌組織——沖洗——10%漂白粉或0.1%升汞浸泡2-5分鐘消毒——沖洗——培養(yǎng)——平板純化——斜面培養(yǎng)2、食用菌的孢子別離法子食體外表處理：1外面有膜包被的用0.1%-0.8%升汞浸泡2-3分鐘消毒2外面無膜包被的用75%的酒精浸泡2-3分鐘消毒多孢子別離法：收集孢子并進(jìn)行培養(yǎng)，移植菌絲培養(yǎng)單孢子別離法：收集與培養(yǎng)別離。先收集孢子，然后在平板上〔馬鈴薯，蔗糖培養(yǎng)基〕進(jìn)行單孢子別離。單細(xì)胞的單孢子別離法1.凹玻片別離法2.濾紙別離法〔自學(xué)〕控制培養(yǎng)條件進(jìn)行別離，與前面講的大同小異，根本上只控制營(yíng)養(yǎng)條件，pH，T和抑制不需要的菌類。厭氧菌的別離培養(yǎng)過程中除氧的方法加復(fù)原劑Cys〔半胱氨酸〕，D型維生素c，硫化鈉等焦性沒食子酸法利用其與氫氧化鈉反響除去氧氣平皿氣厭平培養(yǎng)法〔其實(shí)也是焦性沒食子酸與氫氧化鈉反響〕試管壓氣法〔其實(shí)也是焦性沒食子酸與氫氧化鈉反響〕玻璃板隔絕空氣法〔以美藍(lán)為指示劑〕，藍(lán)色代表缺氧生物吸氧法利用發(fā)芽的燕麥吸氧，使其處于缺氧狀態(tài)第四節(jié)野生型目的菌株的篩選和鑒定一．初篩平板篩選：可根據(jù)水解圈，變色圈，抑菌圈等方法，挑選菌落——含目標(biāo)底物的平板上培養(yǎng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)由于搖瓶振蕩培養(yǎng)更接近于發(fā)酵罐，培養(yǎng)的條件較一致，由此篩選到的菌株易于推廣。菌落——搖瓶——培養(yǎng)——檢驗(yàn)二．復(fù)篩搖瓶培養(yǎng)，但一般為了提高速度與瓊脂平板法和精確的經(jīng)典檢測(cè)相結(jié)合三.菌株鑒定1.分為三個(gè)步驟〔1〕培養(yǎng)獲得該Bac的純種培養(yǎng)物；〔2〕測(cè)定一系列的必要鑒定指標(biāo)，如形態(tài)，特征，生理生化遺傳特征等；〔3〕根據(jù)權(quán)威性的而鑒定手冊(cè)進(jìn)行菌種鑒定。2．四個(gè)水平〔1〕細(xì)胞形態(tài)和習(xí)性水平即形態(tài)特征，運(yùn)動(dòng)性，酶反響，營(yíng)養(yǎng)要求，生長(zhǎng)條件；等條件〔2〕細(xì)胞組分水平：如細(xì)胞組分，脂類，細(xì)胞色素等；〔3〕蛋白質(zhì)水平：如氨基酸順序等；〔4〕DNA的基因水平。如核苷酸序列。第七章工業(yè)Bac誘變育種一、概述1、誘變育種：利用物理和化學(xué)等因素，人為地對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行了誘變處理，然后用合理的篩選程序及適當(dāng)?shù)暮Y選方法把符