中藥生物活性測(cè)定的指導(dǎo)原則解讀課件

2015版藥典四部9105

《中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則》解析研發(fā)室林兵2016.07前言基本原則方法學(xué)驗(yàn)證基本內(nèi)容前言成分復(fù)雜多變活性成分多藥效成分不明確毒性成分不明確給質(zhì)量控制帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)！現(xiàn)代分析手段的大量應(yīng)用中藥質(zhì)量控制水平有了巨大的飛躍中藥特點(diǎn)盡管中藥質(zhì)量控制水平發(fā)展很快,但仍存在一些共性問題:含量高、容易控制的成分未必是藥效成分含量過(guò)低的藥效成分又不能保證與臨床有效劑量之間的關(guān)聯(lián)性用以控制和評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量不夠理想前言2010版《中國(guó)藥典》修訂時(shí)增加了《中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則》2010版藥典一部附錄XⅧC中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則2015版藥典修訂時(shí)將上版藥典附錄整合為通則，并與藥用輔料單獨(dú)成卷作為四部9000指導(dǎo)原則9105中藥生物活性測(cè)定指導(dǎo)原則前言生物活性測(cè)定法：是以藥物的生物效應(yīng)為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定藥物有效性的一種方法，從而達(dá)到控制藥品質(zhì)量的作用。規(guī)范中藥生物活性測(cè)定研究，為該類實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、方法學(xué)建立等過(guò)程和測(cè)定方法的適用范圍提供指導(dǎo)性的原則要求。本指導(dǎo)原則目的藥材來(lái)源廣泛、多變，制備工藝復(fù)雜，使得中藥制劑的質(zhì)量控制相對(duì)困難。多種活性成分和具有多種藥理作用，僅僅控制少數(shù)成分不能完全控制其質(zhì)量和反映臨床療效。中藥基本原則1.符合藥理學(xué)研究的基本原則隨機(jī)Randomization對(duì)照Control重復(fù)Replication具備簡(jiǎn)單、精確的特點(diǎn)，應(yīng)有明確的判斷標(biāo)準(zhǔn)分組或抽樣時(shí)指按照機(jī)遇的原則進(jìn)行，使各受試對(duì)象被分配到各組的機(jī)會(huì)均等，而不受主觀因素的影響。隨機(jī)化的方法有抽簽法、拋硬幣法、隨機(jī)數(shù)字表等。設(shè)置對(duì)照，排除非實(shí)驗(yàn)因素的影響，消除實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性和實(shí)驗(yàn)結(jié)論的正確性。正常對(duì)照、模型對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、溶劑對(duì)照。重復(fù)是指在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行多次研究或多次觀察。重復(fù)原則包括兩個(gè)含義：①是實(shí)驗(yàn)必須有足夠的樣本數(shù)或例數(shù)，在一次實(shí)驗(yàn)中有充分的重復(fù)；②是要使實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，必須多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。也就是說(shuō)，實(shí)驗(yàn)要有一定的次數(shù)?；驹瓌t2.體現(xiàn)中醫(yī)的特點(diǎn)鼓勵(lì)應(yīng)用生物活性測(cè)定方法探索中藥質(zhì)量控制，擬建立的方法的測(cè)定指標(biāo)應(yīng)與該中藥的“功能與主治”相一致?？蓞⒖嫉乃幮W(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?1)治療心肌缺血實(shí)驗(yàn)：垂體后葉致大鼠心肌缺血實(shí)驗(yàn)、小鼠耐缺氧實(shí)驗(yàn)；(2)解熱、鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)：角叉菜膠或細(xì)菌內(nèi)毒素解熱實(shí)驗(yàn)、小鼠扭體實(shí)驗(yàn)；(3)止咳平喘實(shí)驗(yàn)：氨水刺激實(shí)驗(yàn)、離體豚鼠氣管實(shí)驗(yàn)；(4)抗炎解毒實(shí)驗(yàn)：小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)、毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)、抑菌實(shí)驗(yàn)；(5)活血化瘀實(shí)驗(yàn)：血小板聚集實(shí)驗(yàn)、耳廓微循環(huán)實(shí)驗(yàn)?；驹瓌t3.品種選擇合理4.方法科學(xué)可靠?jī)?yōu)先選用生物效價(jià)測(cè)定法，不能建立生物效價(jià)測(cè)定的品種可考慮采用生物活性限值測(cè)定法，待條件成熟后可進(jìn)一步研究采用生物效價(jià)測(cè)定法。詳見四部1431生物檢定統(tǒng)計(jì)法擬開展生物活性測(cè)定研究的中藥材或中成藥應(yīng)功能主治明確，其中，優(yōu)先考慮治療適應(yīng)癥明確單一的中藥注射劑品種，對(duì)急重癥用藥、保護(hù)品種應(yīng)重點(diǎn)進(jìn)行研究?；緝?nèi)容1.實(shí)驗(yàn)條件實(shí)驗(yàn)系括整體動(dòng)物、離體器官、血清、微生物和組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞器、受體、離子通道和酶等。燈盞花素注射液采用整體動(dòng)物進(jìn)行生物活性測(cè)定縮宮素采用大鼠離體子宮平滑肌進(jìn)行生物活性測(cè)定水蛭用凝血酶進(jìn)行生物活性測(cè)定應(yīng)選擇背景資料清楚、影響因素少、檢測(cè)指標(biāo)靈敏和成本低廉的試驗(yàn)系統(tǒng)。應(yīng)盡可能研究各種因素對(duì)試驗(yàn)系的影響，采取必要的措施對(duì)影響因素進(jìn)行控制。試驗(yàn)系的選擇基本內(nèi)容實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，盡可能使用小鼠和大鼠等來(lái)源多，成本低的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并說(shuō)明其種屬、品系、性別和年齡。應(yīng)遵循3R原則：“優(yōu)化、減少、替代”Refinement&Reduction&ReplacementRefinement（優(yōu)化）通過(guò)改進(jìn)條件，善待動(dòng)物，提高動(dòng)物福利，或完善實(shí)驗(yàn)程序和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，避免或減輕給動(dòng)物造成的與實(shí)驗(yàn)?zāi)康臒o(wú)關(guān)的疼痛和緊張不安的科學(xué)方法。Reduction（減少）指在科學(xué)研究中，使用較少量的動(dòng)物獲取同樣多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)或使用一定數(shù)量的地動(dòng)物能獲得更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的科學(xué)方法。Replacement（替代）指使用其他方法而不用動(dòng)物所進(jìn)行的試驗(yàn)，以達(dá)到某一試驗(yàn)?zāi)康摹；蚴鞘褂脹]有知覺的試驗(yàn)材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)基本內(nèi)容適用于需大量動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)，如某些藥物的篩選，半數(shù)致死量的測(cè)定。也較適用于避孕、抗炎鎮(zhèn)痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤及抗衰老等藥物的實(shí)驗(yàn)。小鼠比較適用于抗炎、血壓測(cè)定、利膽、利尿等藥物實(shí)驗(yàn)，也可用于進(jìn)行亞急性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)。大鼠因其對(duì)組胺敏感，并易于致敏，故常用于抗過(guò)敏、平喘和抗組胺等藥物實(shí)驗(yàn)。又因它對(duì)結(jié)核敏感，也用于抗結(jié)核病藥的實(shí)驗(yàn)。豚鼠近交系：BALB/c、C57BL;遠(yuǎn)交系：KM、ICR小鼠；突變系：裸鼠SD、Wistar大鼠基本內(nèi)容供試品選擇應(yīng)選擇工藝穩(wěn)定，質(zhì)量合格的供試品。若為飲片，應(yīng)基源清楚。應(yīng)至少使用三批供試品生物效價(jià)測(cè)定法：首選中藥標(biāo)準(zhǔn)品，也可以考慮化學(xué)藥作為標(biāo)準(zhǔn)品生物活性限值測(cè)定法：可采用中藥成分或化學(xué)藥品作為方法可靠性驗(yàn)證用對(duì)照品。標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌凡捎脴?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌肪鶓?yīng)有理論依據(jù)和/或?qū)嶒?yàn)依據(jù)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中采用的標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌返氖褂脩?yīng)符合國(guó)家有關(guān)規(guī)定要求?；緝?nèi)容2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)原理所選實(shí)驗(yàn)方法的原理應(yīng)明確，所選擇的檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)客觀、專屬性強(qiáng)，能夠體現(xiàn)供試品的功能與主治或藥理作用。生物效價(jià)測(cè)定法：按生物檢定統(tǒng)計(jì)法（通則1431）的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究；生物活性限值測(cè)定法：試驗(yàn)設(shè)計(jì)可考慮設(shè)供試品組、陰性對(duì)照組或陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)定方法需建立動(dòng)物模型時(shí)，應(yīng)考慮設(shè)置模型對(duì)照組。重現(xiàn)性好的試驗(yàn)，也可以不設(shè)或僅在復(fù)試時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組。設(shè)計(jì)類型基本內(nèi)容生物效價(jià)測(cè)定法：供試品和標(biāo)準(zhǔn)品均采用多劑量組試驗(yàn)，并按生物檢定的要求進(jìn)行合理的劑量設(shè)計(jì)，使不同劑量之間的生物效應(yīng)有顯著性差異；生物活性限值測(cè)定法：建議只設(shè)一個(gè)限值劑量，限值劑量應(yīng)以產(chǎn)生生物效應(yīng)為宜；劑量設(shè)計(jì)給藥途徑：一般應(yīng)與臨床用藥途徑一致。如采用不同的給藥途徑，應(yīng)說(shuō)明理由。給藥次數(shù)：根據(jù)藥效學(xué)研究合理設(shè)計(jì)給藥次數(shù)，可采用多次或單次給藥。指標(biāo)選擇：應(yīng)客觀、明確，與“功能主治”基本一致。其他基本內(nèi)容3.結(jié)果與統(tǒng)計(jì)生物效價(jià)測(cè)定法：應(yīng)符合生物檢定統(tǒng)計(jì)法（通則1431）的要求，根據(jù)樣品測(cè)定結(jié)果的變異性決定效價(jià)范圍和可信限率（FL％）限值；生物活性限值測(cè)定法：應(yīng)對(duì)誤差控制進(jìn)行說(shuō)明，明確試驗(yàn)成立的判定依據(jù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量和/或定性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并說(shuō)明具體的統(tǒng)計(jì)方法和選擇依據(jù)。4.判斷標(biāo)準(zhǔn)生物效價(jià)測(cè)定法：應(yīng)按品種的效價(jià)范圍和可信限率（FL％）限值進(jìn)行結(jié)果判斷。生物活性限值測(cè)定法：應(yīng)在規(guī)定的限值劑量下判定結(jié)果，初試結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者，可判定為符合規(guī)定；初試結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義者，可增加樣本數(shù)進(jìn)行一次復(fù)試，復(fù)試時(shí)應(yīng)增設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組，復(fù)試結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定為符合規(guī)定，否則為不符合規(guī)定。方法學(xué)驗(yàn)證1.測(cè)定方法影響因素考察應(yīng)考察測(cè)定方法的各種影響因素，通過(guò)考察確定最佳的試驗(yàn)條件，以保證試驗(yàn)方法的專屬性和準(zhǔn)確性。根據(jù)對(duì)影響因素考察結(jié)果，規(guī)定方法的誤差控制限值或?qū)y(tǒng)計(jì)有效性進(jìn)行說(shuō)明。2.精密度考察重復(fù)性按確定的測(cè)定方法，用3批供試品、每批3次或同批供試品進(jìn)行6次測(cè)定試驗(yàn)后對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。生物活性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果判斷應(yīng)基本一致。中間精密度考察實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部條件改變（如不同人員、不同儀器、不同工作日和實(shí)驗(yàn)時(shí)間）對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，至少應(yīng)對(duì)同實(shí)驗(yàn)室改變?nèi)藛T進(jìn)行考察。重現(xiàn)性生物活性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果必須在3家以上實(shí)驗(yàn)室能夠重現(xiàn)。3.方法適用性考察按擬采用的生物活性測(cè)定方法和劑量對(duì)10批以上該產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)定，以積累數(shù)據(jù)，考察質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中該測(cè)定項(xiàng)目的適用性。例：舒血寧注射液體外抑制血小板聚集的生物活性測(cè)定法藥材選擇：舒血寧注射液功能主治：擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)。方法：生物效價(jià)測(cè)定法模型選擇：血小板聚集抑制模型動(dòng)物：家兔供試品：

舒血寧注射液(5mL/支)對(duì)照品：金納多注射液(5mL/支)試驗(yàn)方法：家兔頸總動(dòng)脈放血75mL，加3.8％枸櫞酸納(1:9)抗凝，1000r/min離心10min制備富血小板血漿(PRP)，剩余血樣繼續(xù)3500r/min離心10min制備貧血小板血漿(PPP)。用血液分析儀測(cè)定PPP和PRP中的血小板數(shù)，利用PPP調(diào)節(jié)PRP中的血小板數(shù)在4.0～4.5×1012個(gè)/L之間。取PPP210μL加入測(cè)試杯，進(jìn)行儀器調(diào)零。再取PRP80μL，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品液20μL，37℃孵育180s，分別加入聚集誘導(dǎo)劑（ADP、PAF）10μL，測(cè)定5min內(nèi)的最大聚集率?！兴幾⑸湟骸δ苤髦蚊鞔_※兩者原料均為銀杏葉提取物量效關(guān)系考察：取金納多注射液，用0.9％的生理鹽水分別配制成梯度為85％、72％、61％、52％、44％的樣品液各1mL，作為對(duì)照品。取舒血寧注射液1支，用0.9％的生理鹽水分別配制成梯度為85％、72％、61％、52％、44％的樣品液各1mL，為供試品。按實(shí)驗(yàn)方法分別測(cè)定含藥血漿的血小板最大聚集率。效價(jià)測(cè)定及可靠性考察：取金納多注射液，同法配置成含注射液100％(原液)、85%、72%的稀釋液，作為對(duì)照品組(S)；取舒血寧注射液，同法配置成含注射液100％(原液)、85%、72%的稀釋液，作為供試品組(T)。按照S1、Tl、T2、S2、S3、T3的順序(排除因S組和T組測(cè)定的先后次序引起的誤差)，平行測(cè)定3次。按《中國(guó)藥典》生物檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線三三法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，考察結(jié)果的可靠性，計(jì)算T組的效價(jià)(PT)和可信限率(FL％)。效價(jià)測(cè)定結(jié)果：由于金納多注射液在藥典中尚無(wú)效價(jià)的規(guī)定，因此假設(shè)對(duì)照品(s)金納多注射液的效價(jià)為100u/mL，由于舒血寧注射液與金納多注射液成分相同，且基本成分的含有量也相同，如果舒血寧注射液抑制血小板聚集的效果與金納多相同，則其測(cè)得效價(jià)也應(yīng)為100u/mL，結(jié)果見表1。表1舒血寧注射液由ADP、PAF誘導(dǎo)的測(cè)得效價(jià)與可信限率可靠性考察結(jié)果：表2，表3為兩種測(cè)定方法的可靠性檢驗(yàn)結(jié)