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澳大利亞植原體候選種檢疫鑒定方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了澳大利重植原體候選種的檢疫鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于澳大利亞植原體候選種寄主種苗中的澳大利亞植原體候選種的檢疫和鑒定。2.1分類地位澳大利亞植原體候選種(candidatusphytoplasmaaustraliense),軟壁菌門(Tendericutes),柔膜菌(randidatusphytoplasma),16SrXⅡ組植原體。2.2檢測(cè)依據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)主要采用形態(tài)生物學(xué)特性與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法對(duì)澳大利亞植原體候選種進(jìn)行檢測(cè)鑒定。對(duì)植物材料進(jìn)行癥狀觀察,發(fā)現(xiàn)有叢枝、黃化、紅葉、卷曲等癥狀則進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè);DAPI熒光染色方法可以作為一種初步檢測(cè)植原體的方法;PCR技術(shù)結(jié)合RFL.P技術(shù)目前是國(guó)際上植原體鑒定分類的主要方法,在本標(biāo)準(zhǔn)中PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)結(jié)合作為鑒定澳大利亞植原體候選種的準(zhǔn)確方法;電子顯微鏡觀察可以清晰、直觀地觀察到植原體粒體形態(tài)。3器材與試劑PCR儀、超凈工作臺(tái)、滅菌鍋、制冰機(jī)、核酸蛋白分析儀,高速冷麻離心機(jī),臺(tái)式小型離心機(jī)、超低溫冰箱、常規(guī)冰箱、旋渦振蕩器、微量進(jìn)樣器、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、熒光顯微鏡、電子顯微鏡。4檢測(cè)與鑒定方法4.1癥狀觀察仔細(xì)觀察種苗是否表現(xiàn)植原體侵染癥狀,癥狀捕述參見附錄A.1。選取幼嫩組織(新葉葉梗,枝梢,莖桿及根部韌皮部組織》,切片,用1μg/mLDAPI溶液(4',6二脒基-2-苯基吲哚)染色,在460mm激發(fā)條件,熒光顯微鏡觀察,在韌皮部鰭管部位有明顯的藍(lán)色熒光信號(hào)A.1.6分子生物學(xué)信息環(huán)狀基因組大小為879324bp.GC含量為27%,且含有一個(gè)3.7kb的質(zhì)粒。基因組含有約839個(gè)閱讀框(ORF),其中約500個(gè)編碼蛋白的基因,337個(gè)基因編碼假定的蛋白,以UGA為終止密碼子。澳大利亞植原體候選種僅編碼一個(gè)基因用于氧化磷酸化作用,僅編碼一個(gè)基因用于甘油脂類代謝,缺失ATP合成途徑、脂肪酸代謝途徑以及二氧化碳固定功能。A.2植原體組胞的富集A.2.1溶液配制植原體細(xì)胞富集緩沖液(100mL):無水K,HPO,1.67g,KH?PO,0.41g,蔗糖10g,牛血清白蛋白0.15g,PVP-102g,維生素C0.53g,用5mol/L的KOH調(diào)節(jié)pH值至7.6。A.2.2植原體細(xì)胞的富集方法稱取新鮮樣品葉中脈1.5g,加入7mL~8mL.新制備的提取緩沖液,50mg的石英砂,于研體中研磨。冰上放置10min~15min,加入5mL相同的緩沖液并搖晃均勻;將懸濁液轉(zhuǎn)移至15ml.離心管,5000r/min使用預(yù)冷的離心轉(zhuǎn)頭(BerkmanJA20)4℃離心5min,將上清液移至另一個(gè)離心管中,19000r/min離心20min,干燥沉淀并用60℃預(yù)熱的2mL2%CTAB溶液,重懸沉淀;60℃水浴中溫浴,并不定期的搖動(dòng)。A.3.1溶液配制DNA提取緩沖液12%CTAB(50℃左右溶解),1.4mol/LNaCl,20mmol/L.EDTA,100mmol/L.A.3.2DNA提取方法將1mL富集樣品轉(zhuǎn)移至2mL離心管,加入1mL.DNA提取緩沖液;將離心管置于65℃水俗中溫俗1h~1.5h,每隔20min左右將離心管順倒混勻;2000g.4℃離心2min;將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管中,加入三氯甲烷/異戊醇(24/1)1mL,混勻,形成孔濁液;將乳濁液在13000g條件下.離心5min;將上清液轉(zhuǎn)入新管,加入800μL預(yù)冷的異丙醇,15000g條件下,離心10min;棄上清液,加入500pl的70%乙醇,在15000g的條件下,離心5min;棄掉上清液,干燥沉淀,加入100pl.的滅菌蒸餾水溶解。其他的DNA提取方法也可以借鑒,也可以選擇使用商業(yè)DNA提取試劑盒,提取的DNA在-80℃的條件下可以凍存1年。5(資料性附錄)電子顯微鏡觀察B.1試劑試材B.1.1鋨酸固定液巴比妥-乙酸緩沖液的1%鋨酸固定液巴比要鈉(C,H?N?O?Na)2.89g乙酸鈉(CH?COONa)1.15g加雙蒸餾水至100ml.2%俄酸水溶液12.5mL加雙蒸餾水至25.0ml.?;旌虾笥?.1mol/1.鹽酸調(diào)至pH為7.2,即為1%鋨酸固定液,在冰箱保存?zhèn)溆谩.1.2戊二醛固定液一般為25%戊二醛水溶液。可配制在除巴比妥以外的任何緩沖液中使用,終濃度為25%。B.1.3環(huán)氧樹脂F(xiàn)pon812順丁烯二酸酐(DDSA)?g二乙基苯胺(D.M,P-30)0.4ml.將Epon812倒入燒杯中,置80℃溫箱融化備用。按上述比例,飄序加入DDSA,充分?jǐn)嚢?,待熔化呈透明,至室溫,再加入鄰苯二甲酸二丁酯,仔?xì)攪排,然后慢慢逐滴加入二乙基苯胺,邊加邊攪排,至包埋劑呈紅棕色。將聚乙烯醇縮甲醛溶于三氯甲烷,配成0.2%~3%溶液,存于冰箱備用。制膜時(shí)取一塊干凈玻璃片插入溶液中,取出傾斜待三氯甲烷揮發(fā),用鑷子沿玻璃邊劃痕,再將玻璃傾斜浸入蒸餾水中,薄膜即從玻璃上脫落下來漂浮于水面,取干凈的銅網(wǎng)擺上,壓緊,在用一塊濾紙覆蓋其上,撈起后置于培養(yǎng)皿干燥備用。B.2實(shí)驗(yàn)步驟選取呈現(xiàn)癥狀的葡萄葉片或者幼敏莖,用刀片切取葉脈、葉柄或者幼嫩枝條,大小為3mm2,取健康葡萄葉片作為陰性對(duì)照。采用戊二醛-鋨酸雙固定法。樣品在25%戊二醛進(jìn)行前固定2h后,PBS(0.2mol/LpH7.4)清洗三次。然后用1%餓酸后固定2h.PBS清洗三次。采用乙醇和系列梯度脫水。30%乙醇/15min→50%乙醇/15min→70%乙醇/15min→80%丙酮/15min→90%丙酮/15min→100%丙酮/15min。樣品可在70%乙醇中停留過夜。脫水后的組織塊在丙酮/樹脂(1:1)中滲透3d,再在全樹脂中滲透1d。用環(huán)氧樹脂做包埋劑。將組織塊放在膠囊中央,滴入包埋劑。于37℃下24h,45℃下24h,60℃下24h。在超薄切片機(jī)上將固化的組織塊作切片。選擇好的切片,將切片用二甲苯蒸發(fā)展開,用載有Formvar膜的銅網(wǎng)撈起,置培養(yǎng)皿內(nèi)干燥、保存。B.2.7切片染色采用乙酸雙氧鈾和檸橡酸鉛雙染色。取染色蠟盤數(shù)個(gè),將乙酸雙氧鈾染色滴入蠟盤上。取帶切片的銅網(wǎng),插人染色滴中,染20min~30min.然后取出銅網(wǎng),蒸餾水洗去多余染液濾紙吸干。將銅網(wǎng)再放入另一蠟盤,滴入檸檬酸鉛染液,使銅網(wǎng)翻扣在染色液滴上,染20min~30min,再用0.1mol/L氫氧化鈉漂洗干凈,濾紙吸干。B.2.8顯微鏡觀察透射電子顯微鏡觀察植原體形態(tài),如A.1.5。(規(guī)范性附錄)通用引物PCR檢測(cè)C.1引物序列植原體通用引物:R16F2n:5'-GAAACGACTGCR16R215'-TGACGGGCGGTGTGTAC.2PCR反應(yīng)體系及參數(shù)C.2.1PCR反應(yīng)體系表C.1PCR反應(yīng)體系補(bǔ)H?O至C.2.2陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照的設(shè)置陰性對(duì)照:以健康的葡萄葉片DNA為模板。陽性對(duì)照;以攜帶有植原體16SrDNA序列的質(zhì)粒為模板。PCR反應(yīng)的空白對(duì)照;以水代替DNA模板。C.2.3PCR的反應(yīng)參數(shù)R16F2n/R16R2:94℃/2min;94℃/1min.60℃/30S,72℃/1min.35個(gè)循環(huán);72℃10min。C.3瓊脂糖凝膠電泳制備1%的瓊脂糖凝膠,以DNAMarker作為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記,進(jìn)行電泳分析,電泳結(jié)束后在凝9(規(guī)范性附錄)虛擬RFLP指紋圖譜分析(R16F2n/R16R2)進(jìn)行虛擬酶切,選用17種限制性內(nèi)切酶(A/xI、BamHI、BfaI、BstU1,DraI、EcwRI.HaeⅢ、HhaI、HinTagI).酶切后RFLP圖譜如圖D.1。此外,使用iPhyelassifier的組(亞組)劃分功能(16Srgroup/suhgroupelassificationbasedonsimilaritycoefficient),可以對(duì)未知植原體進(jìn)行組與亞組的分

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