甾體激素類藥物的分析

甾體激素類藥物的分析基本結(jié)構(gòu)：環(huán)戊烷駢多氫菲ABCD12345678910111213141516171819第一節(jié)基本結(jié)構(gòu)與分類：甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌激素一腎上腺皮質(zhì)激素天然的皮質(zhì)激素--氫化可的松醋酸地塞米松醋酸地塞米松為地塞米松C21位上的羥基所形成的醋酸酯，肌注延長(zhǎng)時(shí)間曲安西龍地塞米松磷酸鈉是地塞米松C21位羥基與磷酸成酯后，又成鹽，增大脂溶性。一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.腎上腺皮質(zhì)激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)

C17

–

α–醇酮基還原性21個(gè)碳，A環(huán)又共扼，17位位有α-醇銅，9α-有F，16α有羥基。二雄性激素與蛋白同化激素丙酸睪酮酯化吸收減慢，作用時(shí)間長(zhǎng)。17位加甲基作用更強(qiáng)蛋白同化激素苯丙酸諾龍---2.雄性激素及蛋白同化激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)

C17–

β–羥基可成酯雄性激素母核有19個(gè)碳原子，蛋白同化激素在碳10位上一般無(wú)角甲基，18個(gè)碳原子。三孕激素黃體酮醋酸甲地孕酮三.孕激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)C17–甲酮基與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)C17–乙炔基與AgNO3反應(yīng)四雌激素炔雌醇炔雌醇雌二醇炔雌酮炔諾孕酮四.雌激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)A環(huán)為3–OH苯環(huán)UV、與重氮苯磺酸鹽反應(yīng)C17–乙炔基與AgNO3反應(yīng)C17–羥基可成酯第二節(jié)鑒別試驗(yàn)一化學(xué)鑒別法（一）與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)母核的反應(yīng)，機(jī)制不明。甾體激素類藥物呈色H2SO4H3PO4HClO4HCl與硫酸顯色反應(yīng)顯色熒光加水稀釋潑尼松龍深紅絮狀↓灰潑尼松橙黃→藍(lán)綠炔雌醚橙紅黃綠↓紅色

炔雌醇橙紅黃綠絮狀↓玫紅醋酸可的松黃或微褪色并澄帶橙清與硫酸成色操作簡(jiǎn)便，依顏色與熒光可區(qū)別，反應(yīng)靈敏，為各國(guó)藥典所用。如中國(guó)藥典：氫化可的松，2mg，硫酸2mg溶解，5分鐘后現(xiàn)棕黃至紅，并顯綠色熒光，此液傾入10ml水中，變黃色至橙黃，有少量絮狀沉淀生成。(二)官能團(tuán)的反應(yīng)腎上腺皮質(zhì)激素藥物呈色四氮唑鹽OHˉ1C17

–

α–醇酮基還原性A.呈色反應(yīng)例如中國(guó)藥典中醋酸潑尼松的鑒別方法：本品1mg，加乙醇2ml溶解，10%2滴。氯化三苯四氮唑試液1ml，顯紅色。腎上腺皮質(zhì)激素藥物Cu2O↓橙紅色堿性酒石酸銅B.酮基沉淀反應(yīng)Ag↓黑色氨制硝酸銀多倫試劑斐林試劑甾酮類激素藥物呈色羰基試劑2.C3–酮基和C20–酮基＃常用的羰基試劑：2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼異煙腙（黃色）睪酮黃體酮異煙雙腙（黃色）

例如黃體酮的鑒別：取供試品0.5mg，與小試管中，加異煙肼1mg，甲醇1mg溶解，顯黃色。具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物呈色亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚芳香醛3.甲酮基的成色反應(yīng)黃體酮藍(lán)紫色亞硝基鐵氰化鈉其他甾體淡橙色不顯色亞硝基鐵氰化鈉是黃體酮專屬而靈敏的反應(yīng)黃體酮藍(lán)紫色雌激素類藥物紅色偶氮染料重氮苯磺酸4.酚羥基的成色反應(yīng)含炔基的甾體激素銀鹽沉淀硝酸銀5.乙炔基的沉淀反應(yīng)↓炔雌醇白有機(jī)氟Fˉ有機(jī)破壞有機(jī)氯Clˉ6.有機(jī)鹵素的反應(yīng)茜素氟藍(lán)硝酸亞鈰硝酸—硝酸銀AgCl↓呈色茜素氟藍(lán)藍(lán)紫色F-鈰

藥典規(guī)定地噻米松磷酸鈉用氧瓶燃燒法處理，在pH4.3條件下與硝酸亞鈰反應(yīng)成藍(lán)紫。脂肪鏈上的氯可水解脫落。中國(guó)藥典規(guī)定氯倍他索，取少許，加乙醇加熱，加硝酸2ml，加硝酸銀數(shù)滴，成白色沉淀。氯在母核上（丙酸倍氯米松）不易脫落，要用氧瓶燃燒法處理。香7酯的反應(yīng)特臭特臭不少藥物是C17或C21上羥基的酯類?？筛鶕?jù)羧酸的性質(zhì)來鑒別，如是醋酸酯可用上述方法鑒別。△二制備衍生物測(cè)定m.p.繁瑣，但專屬性強(qiáng)（一）羰基和氨基縮合后再測(cè)熔點(diǎn)，苯丙酸諾龍的鑒別方法：取本品50mg，加甲醇2ml溶解。加鹽酸氨基脲，4ml，加熱回流，30min，水浴濃縮，過濾，洗，干燥。M.p.182℃?！鳎ǘサ乃狻鳎ㄈ┢渌驶c羥胺成肟KOH羥基與酰氯成酯△４-3-酮240nm苯環(huán)280nm（三）UV法4–3酮型1，4–3酮型1，6–3酮型

用最大吸收波長(zhǎng)的吸光度的絕對(duì)值或兩波長(zhǎng)吸光度之比值進(jìn)行鑒別。如中國(guó)藥典規(guī)定：丙酸倍氯米松的乙醇液（20ug/ml）在239nm處的最大吸收為0.57-0.60。239與263之比值為2.25-2.45。3300～3000cm-13000～2700cm-11900～1650cm-11650～1450cm-11000～650cm-1（三）IR法3750～3300cm-1ν結(jié)構(gòu)特征：酚羥基、C17–OHC17–乙炔基炔雌醇1505cm-1ν3505cm-3300cm-1ν1590cm-13610cm-ν酚羥基醇羥基1615cm-1苯環(huán)的骨架振動(dòng)醋酸可的松結(jié)構(gòu)特征：△4–3–酮、C17–OHC20–酮基、C11–酮基、醋酸酯1630cm-1ν3420cm-亞甲基、角甲基吸收帶1750cm-11232cm-11052cm-1結(jié)構(gòu)特征：△4–3–酮、C17–OHC17–乙炔基炔孕酮1650cm-1ν3300cm-3270cm-1ν1615cm-1五TLC法

主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別方法：對(duì)照品法要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同。炔諾酮TLC圖六HPLC法主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別（如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏）方法：對(duì)照品法要求在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品峰的tR與對(duì)照品峰的tR一致。第三節(jié)、雜質(zhì)檢查（一）其他甾體定義與標(biāo)示藥物結(jié)構(gòu)不同的甾體化合物都稱為“其他甾體”特點(diǎn)（1）可能存在多個(gè)甾體雜質(zhì)（2）結(jié)構(gòu)類似2.來源原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物4.方法（具有一定分離能力）TLC法（高低濃度對(duì)比法）HPLC法（類似高低濃度對(duì)比法）（一）TLC法（高低濃度對(duì)比法）判定方法：規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色氫化可的松檢查其他甾體

取本品加氯仿-甲醇（9：1）制成3.0mg/ml作為供試液，精密量取適量，加氯仿-甲醇（9：1）稀釋成0.06mg/ml作為對(duì)照液；照薄層色譜法，各取5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開后晾干，在105℃干燥10分鐘，放冷，噴以堿性四氮唑藍(lán)試液，立即檢視，供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，不得多于3個(gè)，其顏色與對(duì)照液的主斑點(diǎn)比較，不得更深。12特點(diǎn)：（1）簡(jiǎn)便易行，不需特殊的儀器；（2）需對(duì)照品；（3）只能控制單個(gè)雜質(zhì)的限量；（4）要求雜質(zhì)與主成分的顯色靈敏度接近。（二）HPLC法（高低濃度對(duì)比法）判定方法：規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目規(guī)定雜質(zhì)峰面積

取本品適量，精密稱定，以甲醇為溶劑，配制成每1ml含1mg的溶液（1）與每1ml含0.02mg的溶液（2），用含量測(cè)定項(xiàng)下的方法和溶液，取5μl注入液相色譜儀，調(diào)整儀器靈敏度，使主成分峰高度達(dá)記錄儀的滿量程。再分別取溶液（1）黃體酮檢查其他甾體和溶液（2）各10μl，進(jìn)樣。記錄至主成分峰保留時(shí)間的1.5倍。溶液（1）顯示的雜質(zhì)峰數(shù)不得超過1個(gè)，各雜質(zhì)峰面積及其總和分別不得大于溶液（2）主峰面積的3/4。供試溶液：溶液（1）1mg/ml對(duì)照溶液：溶液（2）0.02mg/ml特點(diǎn)：（1）需特殊的儀器；（2）不需對(duì)照品；（3）可以控制雜質(zhì)的總量；

硒的檢查來源合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫劇毒方法醋酸氟輕松檢查硒

取本品50mg，照氧瓶燃燒法進(jìn)行破壞后，將吸收液轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用水15ml沖洗燃燒瓶及鉑絲，并入吸收液中，用水加至刻度。取硒對(duì)照液（0.05ug/ml）和上述供試品溶液分別用氨試液調(diào)節(jié)pH值至2.00.2后，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水少量分次洗滌燒杯，洗液并入分液漏斗中，使成60ml，各加鹽酸羥胺溶液（1→2）1ml，搖勻后，立即精密加二氨基奈試液5ml，搖勻，在室溫下放置100分鐘，精密加環(huán)己烷5ml，強(qiáng)烈振搖2′，靜置分層，取環(huán)己烷脫水后，測(cè)A378nm。規(guī)定A供＜A對(duì)。（三）有機(jī)溶劑殘留量檢查-甲醇和丙酮（靈敏度法）甲醇不得出峰檢測(cè)限=3.1ng丙酮≤5.0%內(nèi)標(biāo)法+校正因子GC法地塞米松磷酸鈉檢查甲醇和丙酮精密量取甲醇10μl(≈7.9mg)與丙酮100μl(≈79mg)置100ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液20ml，加水至刻度，作為對(duì)照液。精密稱取本品0.16g，置10ml量瓶中，精密加內(nèi)標(biāo)溶液2ml，加水稀釋至刻度，作為供試液；照氣相色譜法測(cè)定，含丙酮不得過5.0%，并不得出現(xiàn)甲醇峰。四游離磷酸鹽對(duì)照品法地塞米松磷酸鈉氫化可的松磷酸鈉倍他米松磷酸鈉氫化潑尼松磷酸鈉原理：方法：地塞米松磷酸鈉檢查游離磷酸精密稱取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加鉬酸銨硫酸試液2.5ml與1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，搖勻，在20℃放置30～50分鐘，照分光光度法，在740nm處測(cè)定吸收度，與對(duì)照液4.0ml同法處理的吸收度比較，不得更大。（對(duì)照液0.0035%KH2PO4）第四節(jié)、含量測(cè)定（一）HPLC法USP、BP、JP均采用RP－HPLC（大多內(nèi)標(biāo)法）（甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對(duì)利用結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)的比色法有干擾）特點(diǎn)用樣量少，靈敏度高，分離效果好，測(cè)定速度快。二UV法△４-3-酮240nm（±）腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯環(huán)280nm（±）雌激素一、炔孕酮的含量測(cè)定取本品，精密稱定，加無(wú)水乙醇溶解并定量稀釋制成每1ml約含10μg的溶液,照分光光度法，在240nm的波處測(cè)定吸光度，按炔孕酮的吸收系數(shù)為390計(jì)算，即得。本法以無(wú)水乙醇為溶劑配制供試品溶液。在最大吸收波長(zhǎng)240nm處測(cè)定吸收度后，按已知的吸收系數(shù)計(jì)算含量，即采用吸收系數(shù)法計(jì)算2.醋酸地塞米松片的含量測(cè)定醋酸地塞米松在240nm處有最大吸收（見圖10-5），中國(guó)藥典采用紫外分光光度法測(cè)定醋酸地塞米松片的含量‘·取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于醋酸地塞米松不5哪），置沐叩叫量瓶中，加乙攀7側(cè)，箕SQ戈一60弋的水攀沖保溫l0min，并時(shí)時(shí)振搖使醋酸地塞米松溶解，放冷至室溫，加乙醉稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液勁汕，置勢(shì)二，加耐量瓶中，加藝薛室刻度，搖勻，吞240nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，按C24H31拍‘韻瞬雌不數(shù)（武篡）為357計(jì)算，三比色法（一）異煙肼比色法1原理：C3－酮基和某些位置上的酮基能在酸性條件下與羰基試劑異煙肼縮合HCl（縮合）異煙腙（黃色）2.方法對(duì)照品法暗45′醋酸地塞米松軟膏含量測(cè)定對(duì)照液：精密稱取醋酸地塞米松對(duì)照品25mg，置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取5ml，用無(wú)水乙醇稀釋至50ml，搖勻。供試液：精密稱取本品適量（約相當(dāng)于醋酸地塞米松25mg），置燒杯中，加無(wú)水乙醇約25ml，置水浴中加熱，攪拌，使醋酸地塞米松溶解，再置冰浴中冷卻，濾過，濾液置100ml量瓶中，同法提取三次，濾液并入量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法：精密量取上述溶液各10ml，分別置具塞容器中，置水浴中蒸去乙醇，殘?jiān)屑勇确?0ml，振搖，使殘?jiān)芙?，各精密?.1%異煙肼甲醇溶液10ml，搖勻，置55℃暗處保溫45分鐘，取出，放冷，用氯仿稀釋至25ml。搖勻，在415nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算即得。3.討論（1）溶劑的選擇異煙肼鹽酸鹽→甲醇、乙醇無(wú)水甲醇無(wú)水乙醇酸、異煙肼的量(2)鹽酸:異煙肼=2:1樣品:異煙肼=1:8→ν↑酸度↑→異煙肼鹽↓酸度↓→A↓t℃↑→ν↑（3）水分、溫度、O2與光線的影響含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時(shí)→O2與光線無(wú)影響（4）關(guān)于反應(yīng)的專屬性反應(yīng)速度C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反應(yīng)對(duì)C3－酮基最敏感。三苯甲瓚↓深紅（二）四氮唑比色法1種類氯化三苯四氮唑（TTC）紅四氮唑（RT）藍(lán)四氮唑（BT）雙甲瓚（暗藍(lán)）

OH-[還原]2原理腎上腺皮質(zhì)激素類藥物的含量測(cè)定方法。C17-α－醇酮基，具強(qiáng)還原性，四氮唑鹽成有色的甲瓚。[O]OH-分子重排反應(yīng)機(jī)制醋酸潑尼松龍軟膏含量測(cè)定對(duì)照液：精密稱取醋酸潑尼松龍對(duì)照品20mg，置100ml量瓶中，加無(wú)水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。3.方法對(duì)照品法供試液：精密稱取本品4g（約相當(dāng)于醋酸潑尼松龍20mg），置燒杯中，加無(wú)水乙醇約30ml，置水浴上加熱，充分?jǐn)嚢?，使醋酸潑尼松龍溶解，再置冰浴中冷卻，濾過，濾液置100ml量瓶中，同法提取三次，濾液并入量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法：精密量取上述溶液各1ml，分別置干燥具塞試管中，各精密加無(wú)水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液2ml，搖勻，再各精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25℃暗處放置40～50分鐘，照分光光度法，在485nm的波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。操作應(yīng)避光。4.討論（1）基團(tuán)對(duì)反應(yīng)速度的影響C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯C16無(wú)論何種取代基ν↓（2）溶劑、水分的影響含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10%含水30%→幾無(wú)反應(yīng)—無(wú)醛無(wú)水乙醇醛→A↑—無(wú)水乙醇（3）堿的種類及加入順序反應(yīng)應(yīng)在強(qiáng)堿性（pH13.75）條件下進(jìn)行以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳加入順序：（4）O2與光線的影響反應(yīng)過程反應(yīng)產(chǎn)物怕光→避光、快速O2影響顏色強(qiáng)度和穩(wěn)定性→隔絕空氣、快速、充N2（5）溫度與時(shí)間t℃↑→ν↑→甲瓚分解↑→%↓ChP25℃40～45′BP30℃1h4.特點(diǎn)：缺點(diǎn)影響因素太多優(yōu)點(diǎn)測(cè)定結(jié)果能指示藥品的穩(wěn)定性（氧化及降解產(chǎn)物無(wú)此反應(yīng)）λmax=465λmax=5151.原理雌激素與硫酸乙醇反應(yīng)呈色（三）Kober反應(yīng)比色法△△2.特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)較高的靈敏度具有一定的選擇性缺點(diǎn)非化學(xué)計(jì)量反應(yīng)反應(yīng)控制條件、注意平行原則1、熟悉本類藥物的分類，掌握其結(jié)構(gòu)特征與分析方法的關(guān)系2、掌握紅外光譜鑒別法及某些官能團(tuán)的呈色反應(yīng)，了解其他鑒別方法3、掌握本類藥物中其他甾體的檢查方法，了解其他特殊雜質(zhì)的檢查第十章復(fù)習(xí)內(nèi)容4、掌握四氮唑比色法、異煙肼比色法的原理、方法及測(cè)定條件。了解UV法、Kober反應(yīng)比色法及HPLC法在其含量測(cè)定中的應(yīng)用參考習(xí)題甾體激素類藥物的結(jié)構(gòu)中能和四氮唑鹽發(fā)生顯色反應(yīng)的基團(tuán)A.酚羥基B.活潑次甲基C.甲酮基D.C17-α-醇酮基E.酮基用異煙肼比色法測(cè)定甾體激素藥物含量時(shí)，其溶液的環(huán)境是A．強(qiáng)酸性B．中性C．強(qiáng)堿性D．弱堿性E．以上都不對(duì)A．維生素B1B．醋酸地塞米松C．兩者皆是D．兩者皆不是31.異煙肼比色法32.硫色素反應(yīng)33.紫外分光光度法34.羥肟酸鐵反應(yīng)35.綠奎寧（Thaciaquin）反應(yīng)BACDD可用于氫化可的松鑒別的試劑有A．氨制硝酸銀B．異煙肼C．紅四氮唑D．硫酸E．重氮苯磺酸可用于甾體激體類藥物的測(cè)定方法有A．高效液相色譜法B．四氮唑鹽法C．紫外分光光度法D．異煙肼比色法E．Kober反應(yīng)比色法能與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)生成蘭紫色的藥物是A．雌二醇B．黃體酮C．醋酸可的松D．苯丙酸諾龍E．以上都不對(duì)各國(guó)藥典對(duì)甾體激素類藥物常用HPLC或GC法測(cè)定其含量，主要原因是A.它們沒有特征紫外吸收，不能用紫外分光光度法B.不能用滴定分析法進(jìn)行測(cè)定C.由于“其它甾體”的存在，色譜法可消除它們的干擾D.色譜法比較簡(jiǎn)單，精密度好E.色譜法準(zhǔn)確度優(yōu)于滴定分析法異煙肼比色法測(cè)定甾體激素類藥物時(shí)，藥物的呈色基團(tuán)是A.酮基B.酚羥基C.活潑次甲基D.炔基E.甾體母核四氮唑比色法可用于下列哪個(gè)藥物的含量測(cè)定A.可的松B.睪丸素C.雌二醇D.炔雌醇E.黃體酮可適用的藥物：A.可的松B.雌二醇C.兩者均可D.兩者均不可亞硝酸鈉滴定法高效液相色譜法能與羰基試劑縮合可用鐵酚試劑比色法測(cè)定可用四氮唑比色法測(cè)定DCABAKober反應(yīng)是A.雌性激素與硫酸乙醇共熱呈色B.皮質(zhì)激素與硫酸一乙醇共熱呈色C.雌性激素與硫酸－乙醇共熱呈色，用水或稀硫酸稀釋后加熱顏色改變D.維生素A與無(wú)水三氯化銻的無(wú)醇氯仿溶液呈色E.異丙嗪于酸性條件下與鈀離子呈色黃體酮在酸性溶液中可與下列哪些試劑反應(yīng)呈色A.2,4-二硝基苯肼B.三氯化鐵C.硫酸苯肼D.異煙肼E.四氮唑鹽Kober反應(yīng)適用于哪一藥物的含量測(cè)定A.黃體酮B.雌二醇C.甲基睪丸素D.甲基炔諾酮