單克隆抗體制備專家講座

單克隆抗體制備Monoclonalantibody單個B淋巴細胞克隆所產(chǎn)生針對同一個抗原決定簇抗體。分三個階段：（1）免疫Balb/c小鼠（2）建立篩選方法和程序（3）雜交瘤生成單克隆抗體制備專家講座第1頁一、動物免疫1Balb/c小鼠6-8周齡，25g左右，雌性較佳2免疫方法（1）首次腹腔免疫0.5ml抗原與福氏完全佐劑1：1混和液，普通2-3只鼠（2）30天后加強免疫，用福氏不完全佐劑單克隆抗體制備專家講座第2頁（3）15天后，尾靜脈注射0.1mL水劑抗原，免疫3天后，去脾臟融合對于抗原性弱抗原，可增加免疫次數(shù)，詳細程序依抗原性質(zhì)而定。單克隆抗體制備專家講座第3頁可溶性蛋白（提取或表示蛋白）50-100μg顆粒性蛋白（病毒）50-100μg細菌106CFU活細胞（哺乳動物細胞）105-7CFU活癌源細胞104-6CFU糖類（多糖、糖蛋白）100-200μg核酸100-200μg單克隆抗體制備專家講座第4頁1在液氮罐中取保留SP2/0細胞，以MEM培養(yǎng)基復蘇，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2在對數(shù)生長久收獲107-108CFUSP2/0細胞3500g離心5min，棄上清4輕輕振動離心管以松動細胞，重懸于20mLMEM營養(yǎng)液中二、骨髓瘤細胞培養(yǎng)單克隆抗體制備專家講座第5頁注意關鍵點：1如細胞外觀不健康，或生長密度不好，應檢測是否有支原體污染2一次用一個凍存管里細胞融合，應防止長久培養(yǎng)3融合細胞要處于對數(shù)生長久單克隆抗體制備專家講座第6頁三、喂養(yǎng)細胞制備1取清潔級ICR小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2將小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜內(nèi)，無菌打開小鼠腹部皮膚4用20mL注射器吸收15mLMEM營養(yǎng)液，注入小鼠腹腔單克隆抗體制備專家講座第7頁5輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器往返抽吸幾次，將小鼠腹腔內(nèi)巨噬細胞吸出，置細胞瓶內(nèi)待用6將喂養(yǎng)細胞轉至50mL離心管內(nèi)，500g離心5min，以HAT培養(yǎng)基重懸細胞，轉至細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)待用單克隆抗體制備專家講座第8頁注意事項：1禁止用燃燒棉球對小鼠消毒2吸收腹腔喂養(yǎng)細胞時，不能將腸道刺破，否則會造成污染3如腹腔里脂肪塊堵塞針頭，應調(diào)整針頭位置，重新吸收細胞液單克隆抗體制備專家講座第9頁四、脾細胞制備1取Balb/c小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2將小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜內(nèi)，無菌打開小鼠腹腔4小心分離出脾臟，置含有7mLMEM營養(yǎng)液培養(yǎng)皿內(nèi)單克隆抗體制備專家講座第10頁5用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾細胞分離出來6用吸管吹打細胞團塊，將細胞懸液吸置50mL離心管中，沉降5min7將細胞懸液吸置另外一支離心管中，500g離心5min，棄上清，沉淀以20mLMEM培養(yǎng)基重懸單克隆抗體制備專家講座第11頁注意事項：1禁止用燃燒棉球對小鼠消毒2取脾臟時，假如脾臟被脂肪粘連，需小心，不能撕裂或撕碎脾臟，更不能將腸道撕破3假如脾臟沒用腫脹，表明免疫效果不好，應選取備用小鼠脾臟單克隆抗體制備專家講座第12頁五、細胞融合及培養(yǎng)1以2：1混合脾臟細胞和SP2/0細胞，加至細胞融合管中2在室溫下500g離心10min，棄上清3輕輕振動離心管以松動和混合細胞，后置37℃水浴4在60S內(nèi)用巴氏吸管將0.8mL預熱至37℃PEG1500遲緩加至細胞內(nèi)，并輕輕抽吸兩次單克隆抗體制備專家講座第13頁5在90S內(nèi)，用移液管輕輕將30mL預熱至37℃MEM培養(yǎng)基加至融合管中37℃水浴5min室溫下500g離心10min，棄上清在融合管內(nèi)加入HAT培養(yǎng)基20mL，將沉淀懸浮，后移置250mL玻璃瓶中，并加入HAT培養(yǎng)基30mL，后加入10-15mL喂養(yǎng)細胞懸液單克隆抗體制備專家講座第14頁9將細胞懸液加至96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2-3滴，約0.1-0.15mL10將細胞培養(yǎng)板置37℃飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11培養(yǎng)3天后可取出細胞板在倒置顯微鏡下觀察細胞融合情況單克隆抗體制備專家講座第15頁12培養(yǎng)置第5天時用HAT培養(yǎng)基換液，換1/2137-8天用HT培養(yǎng)基換液，全部換液1410-14天后，雜交瘤細胞占孔底1/3以上，細胞上清變黃，能夠檢測融合細胞上清里抗體。單克隆抗體制備專家講座第16頁注意事項：1脾臟細胞與SP2/0細胞百分比在2：1—5：1最好2細胞融合是關鍵步驟，防止用力吸打3細胞融合后3天要注意檢驗是否污染，包含細菌和真菌，一發(fā)覺污染，要盡快棄去4換液時不要影響孔底雜交瘤細胞，不要吸出或沖散單克隆抗體制備專家講座第17頁六、雜交瘤細胞篩選大約有10%雜交瘤細胞能分泌抗體，而分泌特異性抗體雜交瘤細胞更少，故需要篩選。篩選抗體分泌細胞有各種方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中間接ELISA應用最廣。單克隆抗體制備專家講座第18頁注意事項：1因單抗是鼠源，故酶標識抗抗體慣用酶標羊抗鼠或兔抗鼠抗體，包含抗IgG、IgM抗體。如單用酶標識抗IgG抗體，則IgM類單抗就不能被篩選出來。2陽性克隆轉移到24孔細胞培養(yǎng)板中，細胞長滿后，上清再檢測一次3篩選方法應在細胞融合前建立好，一部篩選特異單抗方法最好單克隆抗體制備專家講座第19頁七、雜交瘤細胞克隆在分泌特異性單抗雜交瘤細胞中，可能混有不分泌單抗細胞克隆；另外分泌單抗克隆在初代不穩(wěn)定，有一部分細胞染色體常丟失，為了預防不分泌抗體細胞過分生長，在早期應對細胞進行克隆。慣用有限稀釋法，普通來說，雜交瘤經(jīng)過3-4次克隆后就穩(wěn)定了。單克隆抗體制備專家講座第20頁1在克隆前一天，準備數(shù)塊含有0.1mL喂養(yǎng)細胞96孔板2將24孔板里待克隆細胞懸浮，取0.1mL細胞懸液加入0.9mL臺盼藍染色液，混勻3血液計數(shù)板計數(shù)4在24孔培養(yǎng)板上，對待克隆細胞懸液進行10倍比稀釋單克隆抗體制備專家講座第21頁5當稀釋至100CFU/mL時，取1mL細胞懸液至裝有10mLHT培養(yǎng)基瓶中，再分別加至96孔板中（預先加有喂養(yǎng)細胞），0.1mL/孔6將細胞培養(yǎng)板置37℃飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天左右，注意觀察7大約3-4天在倒置顯微鏡下可見細胞克隆，5-7天換液一次，810天左右克隆長滿，能夠檢測上清單克隆抗體制備專家講座第22頁注意事項：1上清液要在24h內(nèi)測定2細胞計數(shù)時只計活細胞（淡藍色），死細胞為深藍色，且沒有光澤3如有高質(zhì)量FCS ，可不用喂養(yǎng)細胞4一個克隆需亞克隆3-4次，才穩(wěn)定5如有孔污染，可向感染孔及臨近孔滴加1mol/mLCuSO4溶液單克隆抗體制備專家講座第23頁七、試驗室規(guī)?？贵w制備體外上清液培養(yǎng)1雜交瘤細胞先在25mL細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2細胞長滿瓶底后轉至50或100mL細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3當細胞液變黃后，搜集上清液，再加新鮮培養(yǎng)液，并重復搜集上清2次4讓細胞長至飽和狀態(tài)，直至死亡，并搜集上清單克隆抗體制備專家講座第24頁體內(nèi)生產(chǎn)腹水1正常培養(yǎng)雜交瘤細胞2喂養(yǎng)Balb/c小鼠，注射細胞一周前經(jīng)過腹腔注射0.5mL降植烷3在細胞對數(shù)生長久收獲細胞，并進行計數(shù)，將細胞數(shù)量以培養(yǎng)液調(diào)整至（2-10）