醫(yī)療器械檢化員微生物培訓(xùn)

關(guān)于醫(yī)療器械檢化員微生物培訓(xùn)一、人員資質(zhì)及培訓(xùn)要求

從事醫(yī)療器械微生物檢驗(yàn)工作的人員應(yīng)具備微生物學(xué)或相近專業(yè)知識(shí)的教育背景。檢驗(yàn)人員應(yīng)依據(jù)所在崗位和職責(zé)接受相應(yīng)的培訓(xùn)，在確認(rèn)它們可以承擔(dān)某一檢驗(yàn)前，他們不能獨(dú)立從事該項(xiàng)微生物檢驗(yàn)。應(yīng)保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必須的設(shè)備操作、微生物檢驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室生物安全等方面的培訓(xùn)，經(jīng)考核合格后方可上崗，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定所有級(jí)別試驗(yàn)人員的繼續(xù)教育計(jì)劃。檢驗(yàn)人員必須熟悉相關(guān)監(jiān)測(cè)方法、程序、檢驗(yàn)?zāi)康暮徒Y(jié)果評(píng)價(jià)。微生物實(shí)驗(yàn)室的管理者其專業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)水平應(yīng)與他們的職責(zé)范圍相符，如：管理技能、實(shí)驗(yàn)室安全、檢驗(yàn)安排、預(yù)算、實(shí)驗(yàn)研究、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)估和數(shù)據(jù)偏差的調(diào)查、技術(shù)報(bào)告書寫等。第2頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天

二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制【原則】實(shí)驗(yàn)室布局設(shè)計(jì)的基本原則是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止檢驗(yàn)過程對(duì)環(huán)境和人員造成危害。通常，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)劃分成潔凈或無菌區(qū)域和活菌操作區(qū)域，同時(shí)應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康模跁r(shí)間或空間上有效分隔不相容的試驗(yàn)活動(dòng)，將交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)降低到最低。一般情況下，醫(yī)療器械微生物檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有開展無菌檢查、微生物限度檢查等檢測(cè)活動(dòng)的、獨(dú)立設(shè)置的潔凈室（區(qū)）或隔離系統(tǒng)，并為上述檢驗(yàn)配備相應(yīng)的細(xì)菌（真菌）等實(shí)驗(yàn)室、培養(yǎng)室、文檔處理區(qū)等輔助區(qū)域，同時(shí)，應(yīng)對(duì)上述區(qū)域明確標(biāo)識(shí)。第3頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制【要求】1、無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。用于無菌檢查和微生物限度檢查的潔凈操作室應(yīng)配有屬于“人流凈化”的更衣室及屬于“物流凈化”的緩沖間或傳遞窗（柜），使進(jìn)入潔凈操作室的實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)物品分別經(jīng)適當(dāng)凈化后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)操作間。無菌室分無菌操作室和緩沖間。無菌操作室應(yīng)具有空氣除菌過濾的單向流空氣裝置。操作室或工作臺(tái)應(yīng)保持正壓。應(yīng)在壓差十分重要的相鄰級(jí)別區(qū)之間安裝壓差表。第4頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制【要求】2、微生物限度檢查的全過程，均應(yīng)遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。因此，微生物限度檢查宜在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行；限度檢查實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配有相應(yīng)的人流和物流緩沖間，并定期作環(huán)境監(jiān)測(cè)。第5頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制

【要求】

3、菌種處理、微生物鑒別和陽(yáng)性對(duì)照室菌種的處理包括的內(nèi)容比較多，如菌種的傳代、保藏、制備以及培養(yǎng)基促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、陽(yáng)性對(duì)照、微生物方法驗(yàn)證、消毒劑和防腐劑的效力測(cè)定和對(duì)環(huán)境中分離菌的鑒別等，這些實(shí)驗(yàn)過程中都在處理活的微生物，處理不當(dāng)會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染，影響其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，該室必須與其他實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格分開；必要時(shí)，應(yīng)按實(shí)驗(yàn)室性質(zhì)的需要保持對(duì)相鄰實(shí)驗(yàn)室的相對(duì)壓差；需采取必要的消毒方式確保實(shí)驗(yàn)室潔凈條件合格（如臭氧，乳酸熏蒸等），以凈化層流臺(tái)作為局部100級(jí)的控制措施，最好是使用生物安全柜，所有的與活毒菌種相關(guān)的活動(dòng)都應(yīng)在層流臺(tái)或生物安全柜中進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要對(duì)層流臺(tái)或生物安全柜及整個(gè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行消毒。所有與菌種相關(guān)的實(shí)驗(yàn)廢物均應(yīng)經(jīng)過滅菌處理后方可丟棄。第6頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制【要求】4、培養(yǎng)室及其他功能間培養(yǎng)室用于放置培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)箱。準(zhǔn)備區(qū)即試液及培養(yǎng)基配制/滅菌區(qū)域、實(shí)驗(yàn)器皿洗滌、烘干、滅菌、實(shí)驗(yàn)用品及易耗品儲(chǔ)藏等沒有特殊要求的功能間，可為一般清潔環(huán)境。第7頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物環(huán)境控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GB/T16292:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子測(cè)試方法GB/T16293:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌測(cè)試方法GB/T16294:2010，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌測(cè)試方法GB50073-2001潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范ISO14644-1:1999潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境第1部分：空氣潔凈度等級(jí)劃分ISO14644-4:1999潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境第4部分：設(shè)計(jì)、施工、運(yùn)行ISO14644-7:1999潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境第7部分：分離的設(shè)備第8頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌室環(huán)境控制設(shè)備微粒計(jì)數(shù)儀第9頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌室環(huán)境控制設(shè)備浮游菌采樣儀第10頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌室環(huán)境控制設(shè)備第11頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天潔凈室沉降菌測(cè)試方法1.測(cè)試時(shí)間1.1對(duì)單向流，如100級(jí)凈化房間及層流工作臺(tái)，測(cè)試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于10min后開始。1.2對(duì)非單向流，如10000級(jí)、100000級(jí)以上的凈化房間，測(cè)試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于30min后開始。2.采樣方法將已制備好的培養(yǎng)皿按要求放置，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5h，再將培養(yǎng)皿蓋蓋上后倒置。2.2.培養(yǎng)全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30℃～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時(shí)間不少于48h。每批培養(yǎng)基應(yīng)有對(duì)照試驗(yàn)，檢驗(yàn)培養(yǎng)基本身是否污染?？擅颗x定3只培養(yǎng)皿作對(duì)照培養(yǎng)。第12頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天潔凈室沉降菌測(cè)試方法3.菌落計(jì)數(shù)用肉眼直接計(jì)數(shù)，標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。若培養(yǎng)皿上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。4.注意事項(xiàng)4.1測(cè)試用具要作滅菌處理，以確保測(cè)試的可靠性、正確性。4.2采取一切措施防止人為對(duì)樣本的污染。4.3對(duì)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。4.4由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計(jì)數(shù)時(shí)一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計(jì)培養(yǎng)皿邊緣生長(zhǎng)的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時(shí)用顯微鏡鑒別。4.5采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個(gè)培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。第13頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天潔凈室沉降菌測(cè)試方法5.測(cè)試規(guī)則5.1.測(cè)試狀態(tài)5.1.1沉降菌測(cè)試前，被測(cè)試潔凈室（區(qū)）的溫濕度須達(dá)到規(guī)定的要求，靜壓差、換氣次數(shù)、空氣流速必須控制在規(guī)定值內(nèi)。5.1.2沉降菌測(cè)試前，被測(cè)試潔凈室（區(qū)）已經(jīng)過消毒。5.1.3測(cè)試狀態(tài)有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，測(cè)試狀態(tài)的選擇必須符合生產(chǎn)的要求，并在報(bào)告中注明測(cè)試狀態(tài)。5.2.測(cè)試人員5.2.1測(cè)試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度級(jí)別的工作服。5.2.2靜態(tài)測(cè)試時(shí)，室內(nèi)測(cè)試人員不得多于二人。第14頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天最少采樣點(diǎn)數(shù)目第15頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天同時(shí)滿足最少平皿數(shù)第16頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天采樣點(diǎn)的布置采樣點(diǎn)的位置可以同懸浮粒子測(cè)試點(diǎn)。a）工作區(qū)采樣點(diǎn)的位置離地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。b）可在關(guān)鍵設(shè)備或關(guān)鍵工作活動(dòng)范圍處增加采樣點(diǎn)。采樣點(diǎn)位置的詳細(xì)規(guī)則見附錄B（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）。第17頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天采樣點(diǎn)布置第18頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天環(huán)境檢測(cè)參照標(biāo)準(zhǔn)第19頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物實(shí)驗(yàn)室管理嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)及清潔區(qū)第20頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB15980-1995一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB15981-1995消毒與滅菌效果的評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)第21頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、滅菌控制

微生物實(shí)驗(yàn)使用的試劑、器材等常需用濕熱滅菌法。濕熱滅菌的溫度和時(shí)間需驗(yàn)證，必須保證物品滅菌后無菌保證值SAL≤10-6。滅菌程序經(jīng)驗(yàn)證合格后方可使用。定期進(jìn)行BD實(shí)驗(yàn)、真空泄漏測(cè)試、溫度參數(shù)測(cè)試（空載熱分布、定載熱穿透、滿載熱穿透）、壓力改變速率測(cè)試（GB8599-2008大型蒸汽滅菌器技術(shù)要求），同時(shí)以生物指示劑驗(yàn)證滅菌效果,必須保證物品滅菌后無菌保證值SAL小于百萬分之一。第22頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、滅菌控制

所有器具應(yīng)采用可靠方法滅菌置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃30min或置電熱干燥箱內(nèi)180℃2h。第23頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天濕熱滅菌控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GB18281.3-2000醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌生物指示物第3部分:濕熱滅菌用生物指示物ISO11138-3-2006醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌.生物指示物.第3部分:濕熱滅菌用生物指示劑第24頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、培養(yǎng)基管理1、培養(yǎng)基的制備2、培養(yǎng)基的貯藏3、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)第25頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、培養(yǎng)基管理靈敏度檢查（中國(guó)藥典2010）無菌檢查（ISO11737.2:2009或GBT19973.2-2005）第26頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、無菌操作定義：是指在執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程中，防止一切微生物侵入機(jī)體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法。無菌操作技術(shù)是微生物實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)，是保證微生物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確和順利完成的重要環(huán)節(jié)。無菌操作技術(shù)主要包括兩方面：創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境及在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入。創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境包括提供密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺(tái)的消毒與檢測(cè)、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。第27頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備微生物實(shí)驗(yàn)控制1：人員管理微生物實(shí)驗(yàn)控制2：環(huán)境控制微生物實(shí)驗(yàn)控制3：滅菌控制微生物實(shí)驗(yàn)控制4：培養(yǎng)基管理微生物實(shí)驗(yàn)控制5：無菌操作第28頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物基本操作

瓊脂平板接種法瓊脂斜面接種法半固體接種法肉湯培養(yǎng)基接種法第29頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂平板接種法細(xì)菌在自然界及人體中分布廣，種類多，為了了解菌譜，須先將各種細(xì)菌分離，獲得純菌培養(yǎng)物后才能進(jìn)一步作細(xì)菌的鑒定。瓊脂平板培養(yǎng)基因面積大，接種后可達(dá)到分離的目的，常稱分離培養(yǎng)法。平板接種方法有多種。以下介紹平行劃線法及分區(qū)劃線法。第30頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）分區(qū)劃線法第31頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）平行劃線法第32頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）第33頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天單個(gè)菌落第34頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天單個(gè)菌落第35頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂斜面接種法目的：多用于純種細(xì)菌的增菌和保存菌種方法：用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)物少許。拔去瓊脂斜面培養(yǎng)基塞，管口經(jīng)火焰上滅菌，將沾有細(xì)菌的接種環(huán)伸入管內(nèi)，自下而上在瓊脂上蜿蜒劃線；接種后，管口在火焰上滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌：在試管口處做好標(biāo)記，置37℃培養(yǎng)18－24小時(shí)第36頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸桿菌斜面金黃色葡萄球菌斜面第37頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天肉湯接種法目的：用于增菌。方法：用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)物少許；以無菌操作將沾有細(xì)菌的接種環(huán)伸入肉湯中，將環(huán)上細(xì)菌輕輕研磨于接近液面的管壁上，然后將試管稍傾斜，使肉湯碰及細(xì)菌即可；接種后管口滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌，并做好標(biāo)記，置37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)第38頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天半固體接種法（穿刺接種法）目的：增菌和保存菌種；觀察細(xì)菌有無動(dòng)力。方法：用接種針，將取有細(xì)菌的接種針自培養(yǎng)基中央刺入（不要接觸管底），沿原穿刺線撥出，注意在刺入與拔出時(shí)不可晃動(dòng)接種針；接種后做好標(biāo)記。置37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)．第39頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%）

第40頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽準(zhǔn)媳葷峁埽菏荕cFarland發(fā)明的一種用于微生物比濁的不同濁度的標(biāo)準(zhǔn)濁度管。具體的配制方法是根據(jù)硫酸和氯化鋇的比例來定的，有表可查，這樣不同比例生成的硫酸鋇沉淀的濃度不同，且都有定值。第41頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天麥?zhǔn)媳葷峁艿呐浔鹊?2頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽静牧稀?、實(shí)驗(yàn)所需的微生物新鮮培養(yǎng)物如：金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物；2、無菌生理鹽水、麥?zhǔn)媳葷峁埽?、酒精燈、接種環(huán)、無菌吸管、平皿。第43頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽痉椒ā?、輕搖標(biāo)準(zhǔn)試管；2、無菌操作挑取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至無菌生理鹽水試管（與標(biāo)準(zhǔn)管相同直徑）中混勻，直到濁度與所要求的標(biāo)準(zhǔn)管的濃度相同；3、序列稀釋已挑取菌落的生理鹽水試管至所需的菌液濃度如：100cfu/ml;4、用平皿計(jì)數(shù)法驗(yàn)證所配置菌液的實(shí)際濃度。第44頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽臼褂眉记伞?、直接用眼睛看（需要經(jīng)驗(yàn)，誤差較大）。2、找張白紙打上平行直線，利用光在不同濃度液體折射不同幫助觀察比較。第45頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天麥?zhǔn)?號(hào)管稀釋梯度表（cfu/ml）第46頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌懸液制備（使用分光光度儀）分光光度儀

第47頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌懸液制備的保存菌懸液制備：菌懸液制備后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在2～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)替代對(duì)應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用。第48頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查

靈敏度檢查所需的六種菌：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]ATCC6538銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]ATCC9027枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]ATCC6633生孢梭菌[CMCC(B)64941]ATCC11437白色念珠菌[CMCC(F)98001]ATCC10231黑曲霉[CMCC(F)98003]ATCC16404根據(jù)培養(yǎng)基的功能選擇靈敏度實(shí)驗(yàn)所需菌種第49頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天中國(guó)藥典2005年版明確規(guī)定：培養(yǎng)基靈敏度、微生物限度檢查法檢查所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查第50頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天中國(guó)藥典2010年版在新增的“藥品微生物實(shí)驗(yàn)室規(guī)范指導(dǎo)原則”中對(duì)菌種有了較為明確的規(guī)定：允許使用標(biāo)準(zhǔn)菌株和商業(yè)派生菌株標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)按保藏機(jī)構(gòu)提供的說明進(jìn)行復(fù)活標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)進(jìn)行純度和特性確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株可用于制備每月或每周一次轉(zhuǎn)種的工作菌株冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用工作菌株不可替代標(biāo)準(zhǔn)菌株，商業(yè)派生菌株僅可用作工作菌株培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查第51頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌株傳代基本概念標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國(guó)內(nèi)或國(guó)際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。（0代）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。（1代）商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。（2代）工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。（2代）代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對(duì)接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。第52頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天采購(gòu)的第2代超低溫冷凍標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種工作菌種第3代工作菌種第3代工作菌種第4代工作菌種第4代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代制備工作菌種進(jìn)行菌種保藏的模式圖第53頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天各類菌種保藏條件及時(shí)間

菌種培養(yǎng)基保存溫度傳種時(shí)間細(xì)菌一般多用于營(yíng)養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基4~6℃芽孢桿菌3~6個(gè)月，其它細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃一般4~6個(gè)月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等4~6℃每4個(gè)月移植一次（每2個(gè)月移植一次）第54頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天

菌種保管

?菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí)，必須做好交接工作。?菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。?各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。?購(gòu)置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報(bào)告。

第55頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天FTM的靈敏度檢查第56頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查接種金黃色葡萄球菌、緑膿桿菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種生胞梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7d,加3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml孢子懸液備用。第57頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查第58頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基質(zhì)量控制：無菌檢查每批滅菌的培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支(瓶)，培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。第59頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌實(shí)驗(yàn)第60頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌實(shí)驗(yàn)預(yù)防假陽(yáng)性措施1在一個(gè)專門準(zhǔn)備、環(huán)境控制的房間內(nèi)的層流罩的環(huán)境中進(jìn)行測(cè)試2在整個(gè)測(cè)試過程中使用無菌技術(shù)3用避免污染的方法把測(cè)試器皿、培養(yǎng)基和測(cè)試物品引入測(cè)試區(qū)4測(cè)試產(chǎn)品表面的細(xì)菌污染，在引導(dǎo)測(cè)試物品進(jìn)入測(cè)試區(qū)之前，先對(duì)產(chǎn)品的外包裝進(jìn)行消毒。5對(duì)測(cè)試中使用的設(shè)備、材料和產(chǎn)品進(jìn)行滅菌6簡(jiǎn)化進(jìn)行測(cè)試必須的操作7盡量避免懸浮微粒的產(chǎn)生8環(huán)境時(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)（沉降菌檢測(cè)）第61頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌實(shí)驗(yàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GBT19973.2-2005-醫(yī)用器材的滅菌微生物學(xué)方法第二部分：確認(rèn)滅菌過程的無菌試驗(yàn)ISO11737-22009-醫(yī)用器材的滅菌微生物學(xué)方法第二部分：確認(rèn)滅菌過程的無菌試驗(yàn)第62頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)條件不論哪種無菌試驗(yàn)方法：FTM32.5±2.5℃，不少于14天；SCDB22.5±2.5℃，不少于14天；改良馬丁23-28℃，不少于14天。如果14以內(nèi)觀察到陽(yáng)性結(jié)果，不必繼續(xù)培養(yǎng)。第63頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供試品．以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗霉菌的供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。加菌量小于l00cfu，供試品用量同供試品無菌實(shí)驗(yàn)時(shí)每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)48～72小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好．第64頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天陰性對(duì)照陰性對(duì)照：陰性對(duì)照供試品無菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋同法操作作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。第65頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌實(shí)驗(yàn)：結(jié)果判斷肉湯培養(yǎng)基有菌生長(zhǎng)的常見三種形式：混濁生長(zhǎng)：液體變混濁。菌膜：液體澄清，表面有一薄層菌膜。沉淀生長(zhǎng)：液體澄清，管底有沉淀物第66頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天混濁生長(zhǎng)：液體變混濁第67頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天肉湯培養(yǎng)基有菌生長(zhǎng)的常見形式第68頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌實(shí)驗(yàn)：結(jié)果判斷1.陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照管應(yīng)無菌生長(zhǎng)2.培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)，如培養(yǎng)14天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，但不能確定是否有微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)兩天，霉菌培養(yǎng)三天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面是否有菌生長(zhǎng)；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。第69頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天

釋出物檢查

第70頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：釋出物檢查目的：對(duì)未知或可疑的供試品，在進(jìn)行無菌試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品在該試驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計(jì)。第71頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：釋出物檢查取滅菌產(chǎn)品以無菌操作轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中,30-35℃培養(yǎng)24hrs；

注意：使用與實(shí)際無菌實(shí)驗(yàn)同種等量的培養(yǎng)基接種每毫升濃度小于100cfu的菌種稀釋液在無菌培養(yǎng)基內(nèi)，一式兩份，其中一份加入無菌試樣，另一份作為陽(yáng)性對(duì)照，并在合適的溫度培養(yǎng)不超過5天。按表1所列菌種重復(fù)以上步驟。第72頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌樣品100cfu菌種＋無菌樣品實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組釋出物檢查在合適的溫度培養(yǎng)不超過5天。選擇合適的微生物，重復(fù)以上步驟。第73頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天釋出物檢查解釋：通過與陽(yáng)性對(duì)照對(duì)比，如果在培養(yǎng)容器內(nèi)看不到微生物生長(zhǎng)，則說明使用的樣品能抑止細(xì)菌或霉菌的生長(zhǎng)?？梢钥紤]使用無菌中和劑，如吐溫80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、β-內(nèi)酰胺酶。如果中和劑無效，增加培養(yǎng)基的量。盡量使用能使試驗(yàn)微生物生長(zhǎng)的最小的培養(yǎng)基的量。第74頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天釋出物檢查常用菌種第75頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天初始污染菌第76頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天定義生物負(fù)載：一件產(chǎn)品和/或包裝上存活的微生物總數(shù)。生物負(fù)載估計(jì)值：通過對(duì)活菌計(jì)數(shù)或滅菌前活菌計(jì)數(shù)加上一個(gè)回收效率補(bǔ)償系數(shù)，得出的組成生物負(fù)載的微生物數(shù)值。第77頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天初始污染菌相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌微生物學(xué)方法第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì)ISO-11737-1:2006GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌微生物學(xué)方法第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì)第78頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天樣品份額取樣原則

1定義：樣品份額(SIP)sampleitemportion，即從某一保健產(chǎn)品單元上取出的用于試驗(yàn)的部分。2取樣注意事項(xiàng)2.1若可操作，試驗(yàn)應(yīng)使用整個(gè)產(chǎn)品單元。但這往往被認(rèn)為是不可行的，產(chǎn)品單元上的樣品份額宜在實(shí)驗(yàn)室易于操作的前提下盡可能大。2.2如果所用的樣品份額((SIP)小于一個(gè)完整的產(chǎn)品單元，則應(yīng)選擇代表產(chǎn)品單元的具有微生物的部分。如果已驗(yàn)證微生物在產(chǎn)品單元上是均勻分布的，應(yīng)從產(chǎn)品單元上任一部位選擇樣品份額。在缺少這些驗(yàn)證的情況下，應(yīng)從產(chǎn)品單元上隨機(jī)選擇幾個(gè)部分作為樣品份額。2.3樣品份額本身應(yīng)對(duì)產(chǎn)品單元內(nèi)的產(chǎn)品有代表性。當(dāng)產(chǎn)品分成不同的部分，可以分裝于兩個(gè)或多個(gè)容器內(nèi)。樣品份額可以根據(jù)供試產(chǎn)品單元的長(zhǎng)度、質(zhì)量、體積或表面積。如果產(chǎn)品單元有標(biāo)簽說明只是液路無菌，宜把液路視為整個(gè)試驗(yàn)單位。(即SIP=1)2.4SIP選擇舉例，見表1第79頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天表1SIP選擇舉例第80頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天表1SIP選擇舉例第81頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天

校正因子第82頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天校正因子定義：用于對(duì)活菌計(jì)數(shù)或滅菌前活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行修正的數(shù)值，以補(bǔ)償產(chǎn)品上無法完全洗脫的微生物，以便計(jì)算出生物負(fù)載估計(jì)值。第83頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天校正因子反復(fù)洗脫方法實(shí)驗(yàn)步驟1取樣品1件或sip，投入一定量的無菌洗脫液中(A)。2樣品的處理采用旋渦混臺(tái)器(2800次／min)，振蕩2min。3注皿：取處理洗脫液A2ml，分別注入兩個(gè)無菌平皿中，每平皿1ml。4再洗脫:將樣品從洗脫液A中取出瀝干，移入另一定量的無菌洗脫液中(B)。5再處理:將B洗脫液置旋渦混臺(tái)器(2800次／min)振蕩2min。6再注皿:取B洗脫液2ml，分別注入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，每平皿lml。注：當(dāng)微生物數(shù)少時(shí),從B洗脫液開始，即可用無菌濾膜過濾后直接放培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7如此反復(fù)洗脫4次．即A、B、C和D，直至洗脫累積量(初始污染菌)不再增加，最后瀝干樣品，將其平鋪于無菌平皿中(E)。然后將熔化并冷至45～48℃的NA培養(yǎng)基，分別注入A～E各平皿每皿15ml。8待凝固后，放置在規(guī)定的培養(yǎng)條件下(30～35℃，48h～82h)培養(yǎng)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。第84頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天校正因子=1/0.3825=2.61

校正因子計(jì)算第85頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天校正因子計(jì)算同批產(chǎn)品，需抽取3-5件，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，確定最小、最大及平均回收率和初始污染菌數(shù)。根據(jù)校正因子，滅菌前初始污染計(jì)數(shù)乘以校正因子即為產(chǎn)品帶菌總數(shù)。第86頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天初始污染菌方法驗(yàn)證檢驗(yàn)洗脫液有無抑菌作用檢驗(yàn)樣品有無抑菌作用第87頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天無菌洗脫液＋初始污染菌樣品＋100cfu菌種1.試驗(yàn)組3.樣品對(duì)照組初始污染菌方法驗(yàn)證（藥典）在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中:洗脫液對(duì)照組(4)的菌回收率應(yīng)均不低于70%。（4/2）×100％試驗(yàn)組(1)的菌回收率應(yīng)均不低于70%（1-3）/2×100％2.菌液組4.洗脫液對(duì)照組100cfu/ml菌種無菌洗脫液＋初始污染菌樣品無菌洗脫液＋100cfu菌種第88頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天初始污染菌方法驗(yàn)證（ISO11737）選用滅菌產(chǎn)品，如果洗脫技術(shù)中用到洗脫液，每一產(chǎn)品都應(yīng)經(jīng)受常規(guī)微生物洗脫技術(shù)，則將一定數(shù)量的易受破壞的微生物放人洗脫液中，回收微生物。選用滅菌產(chǎn)品，如果產(chǎn)品直接放人培養(yǎng)基中，可以參照無菌實(shí)驗(yàn)的抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。第89頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天滅菌產(chǎn)品＋100cfu菌種常規(guī)洗脫回收細(xì)菌數(shù)100cfu/ml菌種1實(shí)驗(yàn)組2對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組回收細(xì)菌數(shù)/對(duì)照組菌數(shù)×100％≥70％初始污染菌方法驗(yàn)證（ISO11737）第90頁(yè),共100頁(yè)，2024年2月25日，星期天微生物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)后環(huán)境控制培養(yǎng)基質(zhì)量滅菌控制人員控制無菌操作方法驗(yàn)證靈敏度實(shí)驗(yàn)無菌檢查無菌實(shí)驗(yàn)初始污染菌B/F驗(yàn)證洗脫液驗(yàn)證樣品無抑菌作用儀器校正沉