單基因遺傳病的研究方法與技術(shù)

關于單基因遺傳病的研究方法與技術(shù)已知致病基因突變分析第2頁,共74頁，2024年2月25日，星期天基因突變第3頁,共74頁，2024年2月25日，星期天基因突變穩(wěn)定突變：傳遞中不改變原有的突變。動態(tài)突變：傳遞中不斷改變自己，多見于短重復序列的突變，在一代代傳遞中重復次數(shù)發(fā)生明顯變化。

第4頁,共74頁，2024年2月25日，星期天三核苷酸重復突變第5頁,共74頁，2024年2月25日，星期天基因突變類型點突變：只有一個或幾個核苷酸的改變，是突變中最多見的形式。突變的結(jié)果分為：

同義突變、錯義突變、無義突變、剪切突變等。堿基的插入和缺失：基因編碼序列中插入或丟失一個或幾個堿基，其結(jié)果是突變點下游堿基序列發(fā)生移碼，編碼氨基酸序列都發(fā)生改變，又稱移碼突變（frameshiftmutation），并可在突變點下游提前出現(xiàn)終止密碼。第6頁,共74頁，2024年2月25日，星期天基因突變類型框內(nèi)突變（inframemutation）：3個或是3的倍數(shù)的堿基缺失或插入導致的突變，使基因丟失或增加1個或幾個氨基酸。DNA大片段缺失或復制（largedeletionorduplication)：幾百個bp至幾十個kb的堿基缺失或復制。

第7頁,共74頁，2024年2月25日，星期天各種類型病理性突變的比例無義突變和移碼突變：60％稀有的錯義突變：20％DNA大片段缺失或重復:20％微小突變第8頁,共74頁，2024年2月25日，星期天基因突變分析所用實驗材料臨床樣本取材：外周血組織毛囊頰粘膜脫落細胞羊水細胞絨毛實驗應用材料：DNARNAProtein第9頁,共74頁，2024年2月25日，星期天RNA的優(yōu)點與缺點優(yōu)點:

不包含內(nèi)含子RT-PCR能夠檢測異常的剪切體缺點:

不易獲得

要求操作特別小心且快速以免降解目的基因可能不在獲得的材料組織中表達

導致RNA不穩(wěn)定的突變不能被檢測第10頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共74頁，2024年2月25日，星期天聚合酶鏈式反應分子雜交基因突變分析常用技術(shù)第13頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Southern印跡雜交第14頁,共74頁，2024年2月25日，星期天例如：脆X綜合征若X染色體在Xq27.3處呈現(xiàn)細絲樣結(jié)構(gòu)，且連接的末端形似隨體，這條染色體就被稱為脆性X染色體。主要臨床癥狀：智力低下、語言障礙、性格孤僻、伴有特殊面容——長臉、方額、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可見明顯大于正常的睪丸。通貫掌、三叉點C缺如。第15頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Xq27.3第16頁,共74頁，2024年2月25日，星期天前突變和全突變正常

CGG<6-54前突變CGG55-200全突變CGG>200第17頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Southern雜交法診斷FragileXF:FullyexpandedandmethylatedNM:MethylatedXdonotcutwithEclXIP:UnmethylatedpremutationN:Xinnormalmaleandactivenormalfemale第18頁,共74頁，2024年2月25日，星期天MullisF"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"聚合酶鏈式反應（PCR）聚合酶鏈式反應于1983年由美國Cetus公司的K.Mullis建立，并和定點突變的發(fā)明者M.Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學獎，為生命科學領域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。第19頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PCR反應的特點特異性強引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性靈敏度高指數(shù)增長，從pg(10-12)可擴增至mg(10-6)水平簡便、快速2～4小時完成擴增對標本的純度要求低

DNA粗制品及總RNA均可作為擴增模板第20頁,共74頁，2024年2月25日，星期天DNA的體外復制包括3個步驟：變性（denaturation）:94C~95C

退火（annealing）:40C~70C

延伸（extension）:72C

3個步驟作為PCR的一個循環(huán)，每當完成一個循環(huán)，一個分子的模板被復制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。PCR反應原理和反應過程第21頁,共74頁，2024年2月25日，星期天5’5’3’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’添加反應混合液及樣本變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入試管中第22頁,共74頁，2024年2月25日，星期天延伸5’3’5’3’5’3’5’3’繼續(xù)延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)第23頁,共74頁，2024年2月25日，星期天5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二個循環(huán)4個拷貝第三個循環(huán)8個拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n個循環(huán)2n個拷貝第24頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PCR反應體系參與PCR反應的主要成份:模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。第25頁,共74頁，2024年2月25日，星期天引物(Primers)

引物決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度化學合成的寡核苷酸能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物的特異性和長度引物設計時必須遵循一些原則

第26頁,共74頁，2024年2月25日，星期天設計引物的原則：二條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負鏈序列互補長度為18~25個核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物的堿基組成應平衡引物的5`端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標記）第27頁,共74頁，2024年2月25日，星期天DNA聚合酶TaqDNA聚合酶復制的保真性：TaqDNA聚合酶無3’→5’外切酶活性，因而無校正功能，在復制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯配。TaqDNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。第28頁,共74頁，2024年2月25日，星期天擴增失敗試劑錯加或漏加實驗中如發(fā)現(xiàn)對照樣本也擴增失敗，可用原試劑重復一次，以確定試劑是否錯加或漏加。試劑失效變性溫度偏低有些DNA所含G、C堿基對豐富，當變性溫度偏低時，雙鏈DNA不能完全解鏈。退火溫度偏高第29頁,共74頁，2024年2月25日，星期天標本中DNA含量過高或雜質(zhì)過多。降低加樣量拖尾可明顯改善。Taq酶加量過大或擴增循環(huán)數(shù)太多拖尾第30頁,共74頁，2024年2月25日，星期天非特異條帶退火溫度低,提高退火溫度。引物特異性不佳，切膠純化特異條帶Taq酶加量過大或擴增循環(huán)數(shù)太多第31頁,共74頁，2024年2月25日，星期天引物二聚體引物量過多：降低引物濃度。引物設計問題操作問題：反應體系建立后，如在室溫放置時間過長，會引起擴增后的二聚體加重。第32頁,共74頁，2024年2月25日，星期天應用PCR相關技術(shù)進行基因突變分析的策略與方法第33頁,共74頁，2024年2月25日，星期天策略與方法直接分析法：PCR片段大小分析：片段大小有明顯差異PCR-RFLP：有酶切位點PCR-測序：確定突變點堿基改變多重連接探針擴增（MLPA）：片段缺失與重復RT-PCR:

基因大，可取到新鮮材料，且基因在其中有表達間接分析法：PCR-STR連鎖分析：基因大；在已知致病基因編碼區(qū)未檢測到突變的家系第34頁,共74頁，2024年2月25日，星期天1.脊髓小腦性共濟失調(diào)脊髓小腦性共濟失調(diào)是遺傳性共濟失調(diào)的主要類型，包括SCA1－27。成年期發(fā)病、常染色體顯性遺傳及共濟失調(diào)等是本病的共同特征，并表現(xiàn)在連續(xù)數(shù)代中發(fā)病年齡提前和病情加重（遺傳早現(xiàn)）。SCA3是我國最常見的脊髓小腦性共濟失調(diào)亞型，基因位于14q24..3－32，含4個外顯子。CAG突變位于4號外顯子，患者擴增拷貝數(shù)為61－89，正常人為12－41。第35頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

NCF1F2F3F4F5PCM應用PCR技術(shù)分析一遺傳性脊髓小腦性共濟失調(diào)（SCA)3型家系NC:正常對照PC:陽性對照F:家系成員M:Marker結(jié)果：家系成員1、3、4有SCA3致病基因突變;家系成員2、5未檢測到突變12345第36頁,共74頁，2024年2月25日，星期天2.脊肌萎縮癥脊肌萎縮癥(SpinalMuscularAtrophy,SMA)系指一類由于下運動神經(jīng)元變性導致的進行性骨骼肌無力和萎縮的一組疾病,是兒童和少年常見的致死性常染色體隱性遺傳病之一,其隱性致病基因攜帶率在人群中為1/40～1/50,發(fā)病率為1/6000～1/10000.第37頁,共74頁，2024年2月25日，星期天應用PCR-RFLP技術(shù)分析脊肌萎縮癥（SMA）致病基因SMNPCR擴增SMN基因exon7,DraI酶切PCR產(chǎn)物.酶切N：正常人PCR產(chǎn)物被酶切為兩條帶酶切P：陽性對照PCR產(chǎn)物被酶切為一條短帶病人1：結(jié)果顯示SMN基因有突變病人2和3：結(jié)果顯示未有突變第38頁,共74頁，2024年2月25日，星期天3.腓骨肌萎縮癥(CMT)CMT是一類周圍神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病,其遺傳方式可為常染色體顯性遺傳(AD,占絕大多數(shù))、常染色體隱性遺傳(AR)及X連鎖顯性遺傳(XD)依據(jù)病理和電生理特點分為兩型:脫髓鞘型(CMT1型)和軸突型(CMT2型).CMT1型約占CMT總數(shù)的70%，70%以上CMT1由PMP22基因重復引起其中X連鎖顯性遺傳CMT致病基因為CX32，含有2個外顯子第39頁,共74頁，2024年2月25日，星期天MLPA分析PMP22基因重復突變第40頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PCR-測序直接分析CX32基因來診斷X連鎖腓骨肌萎縮癥第41頁,共74頁，2024年2月25日，星期天4.假肥大型肌營養(yǎng)不良癥

假肥大型肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺傳性疾病，在2500個活產(chǎn)男嬰中即有一個患者致病基因DMD含有79個外顯子

DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%-70%第42頁,共74頁，2024年2月25日，星期天MLPA

技術(shù)簡介MLPAMultiplexligation-dependentprobeamplification鏈接依賴型多探針擴增技術(shù)最早由荷蘭人SchoutenJP(SchoutenJPetal,2002)在原有PCR技術(shù)上發(fā)展出來第43頁,共74頁，2024年2月25日，星期天MLPA

技術(shù)原理第44頁,共74頁，2024年2月25日，星期天MLPA方法檢測DMD

12345第45頁,共74頁，2024年2月25日，星期天5.成人型多囊腎是一種最常見的單基因遺傳性腎病，發(fā)病率約為1/1000其主要特征在雙腎形成進行性增長的多個液性囊腫，最終可引起腎衰竭具有遺傳異質(zhì)性，存在兩個主要的致病基因PKD1和PKD246第46頁,共74頁，2024年2月25日，星期天47ADPKD分子遺傳基礎GenePKD1PKD2PKD3?Chromosomallocus16p13.34q22-23ClonedYesYesPercentage~85%~15%Exons/Single-copyexons46/Ex35-4615/Ex1-15Mutationnumber343100HotmutationNoNo第47頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PKD1基因結(jié)構(gòu)的復雜性第48頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PKD基因分析:直接基因突變分析：適于散發(fā)病例和小家系病例。具有結(jié)果判讀的不確定性連鎖分析:

適于分析在已知致病基因編碼區(qū)未檢測到突變的較大家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例49第49頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PCR-測序分析在PKD1外顯子編碼序列上發(fā)現(xiàn)無義突變，使突變堿基所在密碼子由CGA變?yōu)榻K止密碼子TGA。第50頁,共74頁，2024年2月25日，星期天連鎖分析結(jié)果第51頁,共74頁，2024年2月25日，星期天新致病基因的研究方法和技術(shù)第52頁,共74頁，2024年2月25日，星期天家系連鎖分析來定位:

適于分析較大的遺傳病家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例二代測序技術(shù)：適于散發(fā)病例和小家系病例研究對象不同，策略方法不同

連鎖分析與二代測序相結(jié)合加快新基因的發(fā)現(xiàn)第53頁,共74頁，2024年2月25日，星期天ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMetValSerLeuGlnProMetValSerLeuStop定位克隆第54頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。連鎖分析第55頁,共74頁，2024年2月25日，星期天DNASTRSNP常見遺傳標記第56頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PCR-STR連鎖分析CACACAPrimer1Primer2CACACACACACACACACACACACACACACA第57頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第58頁,共74頁，2024年2月25日，星期天毛細管電泳分析PCR片段大小第59頁,共74頁，2024年2月25日，星期天分析D4S1534D4S2929D4S2460D4S423I-1114,124176,178200,202105,112II-1114,120153,159200,202107,109II-2114,124157,176202,204105,112II-3114,122157,178200,202102,105II-4114,124157,176202,204105,112II-5114,124157,176198,202107,109III-1114,124153,176200,202109,112III-2114,124176,176202,202109,112第60頁,共74頁，2024年2月25日，星期天連鎖分析結(jié)果第61頁,共74頁，2024年2月25日，星期天均勻分布于23對染色體上的STRSNP芯片通過全基因組掃描來定位基因第62頁,共74頁，2024年2月25日，星期天外顯子組測序用二代測序技術(shù)尋找致病基因全基因組測序第63頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第64頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第65頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第66頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第67頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第68頁,共74