小反芻獸疫病毒實時熒光 RT-PCR 檢測方法

1DBXX/XXXXX—XXXX小反芻獸疫病毒實時熒光RT-PCR檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了小反芻獸疫病毒實時熒光RT-PCR檢測方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于在生物安全Ⅱ級（BSL-2）以上的實驗室進行小反芻獸疫病毒病的診斷、監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，適用于反芻動物血液血清、淋巴結(jié)及口鼻棉拭子中小反芻獸疫病毒核酸的RT-PCR檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。農(nóng)業(yè)部關(guān)于印發(fā)《病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范》的通知（農(nóng)醫(yī)發(fā)[2017]25號）GB/T19495.2-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第302號（《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》）3縮略語下列縮略語適用于本標(biāo)準(zhǔn)。PPRV：小反芻獸疫病毒（PestedesPetitsRuminantsvirus）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）RNase：核糖核酸酶（ribonuclease）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）bp：堿基對（basepair）RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscriptionpolymerasechainreaction）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）PBS：磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution）TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸電泳緩沖液（Trisacetate-EDTAbuffer）4原理本方法針對小反芻獸疫病毒高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含小反芻獸疫病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。5儀器和器材5.1臺式冷凍離心機（離心范圍0～20000r/min）5.2冰箱：4℃±1℃,-20℃±1℃,-80℃±1℃2DBXX/XXXXX—XXXX5.3全自動熒光定量PCR儀（ABI7000、ABI7300、ABI7500、ABI7900、BIO-RadCFX384Touch、BIO-RadCFX96Touch等）5.4離心管：15mL、1.5mL和0.2mL。5.5微量可調(diào)移液器：100～1000μL，20～200μL，10～100μL，5～50μL，2～20μL，0.5～106試劑和引物6.1RNA抽提試劑：Trizol外觀為淡粉色，于4～8℃保存。6.2氯仿：-20℃預(yù)冷。6.3異丙醇：-20℃預(yù)冷。6.4DEPC水：去離子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h或室溫過夜，121±1℃高壓滅菌15min。6.575%乙醇：用無水乙醇和DEPC水配制，-20℃預(yù)冷。6.6陽性對照：PPRV細胞培養(yǎng)物。6.7陰性對照：滅菌水。6.8PrimeScriptTMoneStepRT-PCRkitVer.2試劑盒。6.9PBS：磷酸鹽緩沖液（0.02mol/LpH7.2）。6.10引物：用于RT-PCR反應(yīng)的引物濃度為20μmol/L。注：本標(biāo)準(zhǔn)中使用的試劑，除另有說明外，所有實驗使用的試劑等級均為不含RNA或RNase的分析純或生化試劑；所有試劑均用無RNA酶污染的無菌的容器分裝。7操作步驟7.1采樣與樣品的前處理7.1.1口鼻棉拭子樣品采樣時要將拭子深入口腔、鼻腔來回刮3~5次，取口腔、鼻腔分泌液，將拭子放入有1.0mLPBS的離心管中備用。7.1.2血液或血清樣品采用靜脈采血方法，使用無菌注射器抽取羊只血液樣品置于離心管中待檢或者靜置后取上清待檢。7.1.3淋巴結(jié)樣品取少量樣品（2~3g）于研缽或勻漿器中研磨,加10mLPBS混勻，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中，4℃,3000r/min離心10min取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1.5mL離心管中，編號待檢。7.1.4存放與運輸3DBXX/XXXXX—XXXX采集或處理的樣品在2～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，應(yīng)放置-80℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，在6～8h之內(nèi)運送到實驗室檢測。按照《獸醫(yī)實驗室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進行樣品的生物安全標(biāo)識。7.2熒光RT-PCR檢測7.2.1RNA提取RNA的提取可采用手動提取或者使用商品化試劑盒提取，但是注意提取時設(shè)立陽性對照、陰性對照。7.2.1.1手動提取RNA的操作步驟7.2.1.1.1將750μLTrizol加入1.5mL滅菌離心管中，然后加入250μL待檢樣品，顛倒混勻后室溫靜置3～5min。7.2.1.1.27.2.1.1.2再加入250μL氯仿，混勻器上振蕩混合15s（或用手反復(fù)顛倒混勻），4℃下13000r/min離心15min。7.1.1.1.3小心吸取450μL上清液轉(zhuǎn)移至裝有500μL異丙醇的1.5mL滅菌離心管中，顛倒混勻。-20℃室溫靜置15min，4℃13000r/min離心10min。7.1.1.1.4棄上清液，加入1mL75%的DEPC乙醇，4℃下13000r/min離心10min。重復(fù)洗滌2次。7.1.1.1.54000r/min離心10s，用微量移液器小心將殘余液體吸干，室溫干燥3～10min。7.1.1.1.6干燥后用20μLDEPC水溶解管壁上的RNA，冰上保存?zhèn)溆?；若需長期保存應(yīng)放置-70℃冰箱。7.2.1.2試劑盒提取RNA嚴(yán)格按照合法的商品化RNA提取試劑盒說明書進行操作。7.2.2反應(yīng)體系的配制反應(yīng)體系的成分：去離子水7.5ul，上游引物PPRVF0.5ul，下游引物PPRVR0.5ul，探針PPRVP(10umol/L)0.5ul，2╳qPCRMasterMix12.5ul，Taq聚合酶0.5ul，反轉(zhuǎn)錄酶0.5ul，加入PCR反應(yīng)管后震蕩離心混勻。7.2.3加樣7.2.3.1打開PCR反應(yīng)管蓋，加入PCR反應(yīng)液20μL,加入樣本模板5μL，陽性對照和陰性對照也各加5μL，記錄加樣順序。7.2.3.2蓋好PCR管蓋，將PCR反應(yīng)液與樣本模板振蕩混勻后，4℃,2000r/min，離心10s。7.2.3.3將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到PCR區(qū)進行上機。7.2.4PCR過程7.2.4.1開機預(yù)熱并檢驗儀器性能。7.2.4.2取樣本準(zhǔn)備區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在儀器樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序。4DBXX/XXXXX—XXXX7.2.4.3按表1設(shè)置儀器擴增相關(guān)參數(shù)，進行PCR擴增表1儀器擴增相關(guān)參數(shù)118試驗成立條件與結(jié)果判定8.1試驗成立條件陽性對照：Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的S型曲線。陰性對照：Ct值＞43或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。試驗成立，參考圖如下：8.2結(jié)果判定陽性：樣本檢測結(jié)果Ct值≤40，有明顯指數(shù)增長，表明樣本中檢測出該病毒核酸；陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值＞43或無Ct值，表明樣本中未檢測出該病毒核酸；可疑：樣本檢測結(jié)果Ct值在40~43范圍，判定為可疑；此時應(yīng)對樣本進行重復(fù)檢測，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在40~43