整個基因克隆實(shí)驗(yàn)作業(yè)流程完整

組織總RNA提取相關(guān)試劑：Trizol；氯仿；苯酚；異丙醇；75%乙醇；RNase-free水相關(guān)儀器：制冰機(jī)；液氮&研缽/生物樣品研磨儀；高速離心機(jī)；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；渦旋振蕩儀；恒溫金屬浴。相關(guān)耗材：解剖工具，冰盒，離心管，離心管架，吸頭（1ml，200μl/300μl），一次性手套，試驗(yàn)手套。試驗(yàn)步驟取暫養(yǎng)草魚，冰上放置一段時間，然后解剖，剪取腸道50~100mg，放入研缽中，加入液氮快速研磨，然后加入1ml預(yù)冷TRIzol試劑，充足研磨至無顆粒物存在。轉(zhuǎn)移到離心管中，室溫放置5min，使細(xì)胞充足裂解；按1mlTrizol加入200μl氯仿，蓋上蓋子，快速充足搖勻15s，然后室溫放置3min；4℃，,1g此時混合物分為三層，下層紅色苯酚氯仿層，中間層和上層無色水相；RNA存在于無色水相中；小心吸收上清液，千萬不要吸收中間界面，不然有DNA污染；轉(zhuǎn)移至一個新離心管，加入等體積異丙醇，輕輕混勻；室溫放置10min；4℃，,1g離心10min；棄上清，加入1ml75%乙醇洗滌；渦旋，懸浮沉淀；4℃，,1g離心5min；棄上清；能夠再次用75%乙醇洗滌沉淀；棄上清；用移液器輕輕吸收管壁或管底殘余乙醇，注意不要吸收沉淀；室溫放置5min晾干沉淀；（RNA樣品不要過于干燥，不然極難溶解）沉淀中加入30μlRNase-free水，輕彈管壁，使RNA溶解。RNA質(zhì)量檢測相關(guān)試劑：溴酚藍(lán)，TEB/TAE電泳緩沖液，溴乙錠（EB）相關(guān)儀器：（超微量分光光度計(jì)，移液器（2.5μl或2μl規(guī)格，10μl規(guī)格），電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，制冰機(jī)）相關(guān)耗材：（無菌無絨紙，吸頭，離心管架，PCR管，PCR管架，錐形瓶，燒杯，一次性手套，試驗(yàn)手套，冰盒）（1）RNA純度檢測：測定其OD260和OD280值，依據(jù)其OD260/OD280比值，當(dāng)其比值在1.9~2.1之間，說明提取總RNA純度比較高，沒有蛋白質(zhì)和基因組污染。（2）RNA完整性檢測：取2μlRNA，和2μl溴酚藍(lán)混勻，用1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，20min后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察效果。當(dāng)28S和18S條帶清楚，且亮度比大約是2:1時，5S條帶若隱若現(xiàn)，而且沒有其它條帶時，說明完整性不錯，能夠用于下游逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。逆轉(zhuǎn)錄（RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA）相關(guān)儀器：（PCR儀/恒溫金屬浴，移液器（2.5μl或2μl規(guī)格，10μl規(guī)格），100μl冰盒，制冰機(jī)，PCR管）依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO企業(yè)）說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系及條件以下：試劑使用量（μl）RnaseFreeH2O11.75-YOligo（dT）1TotalRNA（<1000ng）YTotalVolume12.7565℃試劑使用量（μl）上一步變性后RNA溶液12.755×RTBuffer4dNTPMixture（各10mM）2RnaseInhibitor（10U/μl）0.25ReverTraAce1TotalVolume20然后放置于PCR儀上，反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。所得cDNA放置于-20℃保留。PCR反應(yīng)相關(guān)儀器：（PCR儀/恒溫金屬浴，移液器（2.5μl或2μl規(guī)格，10μl規(guī)格），100μl電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，冰盒，制冰機(jī)）試劑使用量（μl）ddH2O6.0反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.010×PCRBuffer1.0dNTP（10mmol/l）0.2Taq酶（1U/μl）0.4Ghrelin-F（10μmol/l）0.4Ghrelin-R（10μmol/l）0.4MgCl2（25mmol/l）0.6TotalVolume10反應(yīng)條件：95℃,預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產(chǎn)物分離，回收和純化相關(guān)試劑：膠回收試劑盒相關(guān)儀器：（紫外照膠儀，移液器（200μl，1ml規(guī)格），離心機(jī)，恒溫金屬浴，渦旋混勻儀，制冰機(jī)，超微量分光光度計(jì)）相關(guān)耗材：（切膠刀片，吸頭，離心管架）PCR反應(yīng)得到目標(biāo)條帶后，加大反應(yīng)體積，然后依據(jù)膠回收試劑盒說明書進(jìn)行目標(biāo)片段回收純化。將所得DNA貯存于-20℃目標(biāo)片段和載體連接相關(guān)儀器：（恒溫金屬浴，移液器（10μl，2.5μl規(guī)格）渦旋混勻儀，制冰機(jī)）根據(jù)連接試劑盒(TAKARA企業(yè))說明書進(jìn)行操作。pMD-18T載體1μlDNA 2μlddH2O 2μl然后加入5μlLigationMix，4℃/16℃放置過夜連接。轉(zhuǎn)化相關(guān)儀器：（超凈工作臺，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，恒溫?fù)u床，恒溫金屬浴/水浴鍋，移液器（1000μl，100μl，10μl，2.5μl規(guī)格）渦旋混勻儀，制冰機(jī)）CaCl2法制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞全過程冰上進(jìn)行，4℃離心，無菌操作。（1）以接種環(huán)從-80℃保留高效轉(zhuǎn)化菌種蘸取少許菌液劃無抗生素平板，培養(yǎng)12h；（2）挑取單菌落接種于1ml無抗生素LB培養(yǎng)基中，37℃猛烈震蕩培養(yǎng)6h；（3）按1:100接種菌液于25mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)1.5～2h，至OD600達(dá)0.4～0.6；（這一步很關(guān)鍵，培養(yǎng)過分菌液含有較多“老”細(xì)胞，制備成感受態(tài)細(xì)胞后其接收外援DNA能力較低，從而造成轉(zhuǎn)化率降低）（4）冰上預(yù)冷10min；然后4℃，6000rpm離心10min；（6）棄上清，將細(xì)菌沉淀重新懸浮于25ml預(yù)冷0.1MCaCl2中，冰浴20min；（7）4℃，6000rpm離心10min，棄盡上清；（8）以1.25ml（菌液體積5%）預(yù)冷0.1MCaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，同時加入0.3ml預(yù)冷100%甘油（甘油終濃度達(dá)15～20%），混勻后按每支100μl在冰上分裝。-80℃保留備用。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞（1）將10μl連接產(chǎn)物加入100μl感受態(tài)菌液中，冰上放置30min；（2）然后放到42℃水浴鍋中熱激90s，再在冰上放置3min；（3）加入890μlLB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)60min；（4）每個培養(yǎng)平板中加入40μlX-gal和4μlIPTG，然后吸收100μl菌液，均勻涂布于含AmpLB固體培養(yǎng)基平板上；（5）37℃培養(yǎng)箱中正放1h，待菌液被瓊脂完全吸干后，倒置平板，過夜培養(yǎng)16h。（培養(yǎng)時間不宜過長，不然有衛(wèi)星菌落產(chǎn)生）菌液PCR檢測相關(guān)儀器：（PCR儀/恒溫金屬浴，渦旋混勻儀，移液器（10規(guī)格，1000μl規(guī)格），100μl電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，冰盒，制冰機(jī)）在平板上挑取10～20個白色菌落，加入含有1mlAmp+LB液體培養(yǎng)基1.5ml離心管中，37℃震蕩培養(yǎng)6h。3000rpm離心3min后吸掉上層400μ附注：關(guān)鍵溶液和培養(yǎng)基配制1）電泳緩沖液10×TBE：108gTris堿，55g硼酸，20ml0.5MEDTA，加入蒸餾水混勻后定容至1000ml，調(diào)整pH為8.0；2）LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g；加800ml去離子水，用10MNaOH調(diào)整pH至7.0，定容至1000ml，高壓（1.034×100000Pa）滅菌20min，4℃3）LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為1.5%，高溫、高壓滅菌20min后降溫至50~60℃，在無菌狀態(tài)下鋪制平板，室溫放置過夜后，置于44）氨芐青霉素貯存液：用無菌雙蒸水配成100mg/ml，分裝，-20℃5）用于制備感受態(tài)細(xì)胞CaCl2（0.1mol/l）：稱取0.56gCaCl2（無水，分析純），溶解于50ml雙蒸水中，定容至100ml，高壓滅菌；6）X-gal（20mg/ml）配制：將20mgX-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃7）IPTG（200mg/ml）配制：將0.2gIPTG溶于1ml去離子雙蒸水中，0.22μm濾膜除菌，-20℃

3’RACE（dT）17-接頭引物：5’GACTCGAGTCGACATCGA(T)173’接頭引物：5’GACTCGAGTCGACATCG3’cDNA合成DEPC水9.75μlOligodT接頭引物1μlTotalRNA2μl(<1000ng)65℃,5min；立即置于冰上。第一步變性后RNA溶液12.75μl5×RTBuffer4μldNTPMixture（各10mM）2μlRnaseInhibitor（40U/μl）0.25μlReverTraAce1μl總體積20μl反應(yīng)條件：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。cDNA純化利用膠回收試劑盒進(jìn)行（去除多出dNTP和引物）。最終使用20μlTE洗脫沉淀。第一輪PCRcDNA1μl10×Buffer1μldNTP（10mmol/L）0.2μlOligodT接頭引物(10μmol/L)0.4μl3’RACE外引物(10μmol/L0.4μlTaq酶(1U/μl)0.4μlMgCl2（25mmol/L）0.6μlddH2O6.0μl反應(yīng)條件：降落PCR。PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模板進(jìn)行下游試驗(yàn)。第二輪PCRcDNA1μl10×Buffer1μldNTP（10mmol/L）0.2μl接頭引物(10μmol/L)0.4μl3’RACE內(nèi)引物(10μmol/L0.4μlTaq酶(1U/μl)0.4μlMgCl2（25mmol/L）0.6μlddH2O6.0μl反應(yīng)條件：降落PCR。

5’RACEcDNA合成DEPC水9.75μl基因特異性反義引物1μlTotalRNA2μl(<1000ng)65℃,5min；立即置于冰上。第一步變性后RNA溶液12.75μl5×RTBuffer4μldNTPMixture（各10mM）2μlRnaseInhibitor（40U/μl）0.25μlReverTraAce1μl總體積20μl反應(yīng)條件：42℃,60min；99℃,5min；16℃,5min。cDNA純化利用膠回收試劑盒進(jìn)行（去除多出dNTP和引物）。最終使用20μlTE洗脫沉淀。cDNA加尾純化后cDNA5.7μl5×末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液2μl1mmol/ldATP2μl末端轉(zhuǎn)移酶（30U/μl）0.3μl總體積10μl反應(yīng)條件：37℃,60min；70℃，10min。反應(yīng)結(jié)束，把cDNA稀釋1倍作模板進(jìn)行下游試驗(yàn)。第一輪PCRcDNA1μl10×Buffer1μldNTP（10mmol/L）0.2μlOligodT接頭引物(10μmol/L)0.4μl5’RACE外引物(10