《DB32T 4234-2022水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法》

ICS67.120.30

CCSB50

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T4234—2022

水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組

酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法

DetectionmethodforVibrioparahaemolyticusinaquaticbyreal-timefluorescence

recombinase-aidamplification

2022-03-18發(fā)布2022-04-18實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T4234—2022

水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法

1范圍

本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增（recombinase-aid

Amplification，RAA）法的試劑材料、儀器設(shè)備、檢測(cè)程序、操作步驟、結(jié)果判定和報(bào)告、檢出限及防

止污染措施。

本文件適用于水產(chǎn)品中副溶血性弧菌檢測(cè)。

本文件適用于水產(chǎn)品副溶血性弧菌的快檢初篩。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB4789.7食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增recombinase-aidAmplification,RAA

一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過(guò)程，在恒溫下（一般為

37℃～42℃），進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)。

4原理

RAA法利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替了傳統(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過(guò)程。根據(jù)副溶血性弧

菌的特異性基因序列，結(jié)合熒光探針檢測(cè)法對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖及水體中副溶血性弧菌進(jìn)行判定。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RAA

擴(kuò)增后，根據(jù)樣品在30min內(nèi)是否出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，可判定樣品結(jié)果。

5試劑材料

除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682的要求。所有試劑均用無(wú)DNA

酶污染的容器分裝。試劑材料有：

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a)探針和引物

根據(jù)副溶血性弧菌的特異性基因序列設(shè)計(jì)探針和引物。

表1副溶血性弧菌探針和引物

致病菌種類(lèi)引物探針名稱(chēng)序列（5'-3'）目的基因

上游引物tlh-FTTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACGtlh

下游引物tlh-RAGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGA

副溶血性弧菌

exo探針tlh-PTTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTC[FAM-dT][THF

]A[BHQ-dT]ACAACCACACGAT-SpacerC3

b)試劑

1）RAA反應(yīng)緩沖液：20%PEG，280mmol/L醋酸鎂（MgAc2）。也可采用等效的商品試劑盒。

2）凍干酶制劑：1mmol/LdNTP、90ng/μL單鏈結(jié)合蛋白、120ng/μLrecA重組酶、30ng/μLBsuDNA

聚合酶、30ng/μLExoIII、100mmol/LTricine、20%PEG、5mmol/L二硫蘇糖醇、100ng/μL肌酸激酶，

保存于200μL反應(yīng)管中。也可采用等效的商品試劑盒。

3）陽(yáng)性對(duì)照：副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802，或含目的片段的DNA；陰性對(duì)照：非副溶血性弧

菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，或不含目的片段的DNA；空白對(duì)照：無(wú)菌水。

6儀器和設(shè)備

包括以下幾種：

a)熒光檢測(cè)儀：帶有恒溫（39℃±1℃）擴(kuò)增功能的熒光檢測(cè)儀。

b)微量移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～200μL，

100μL～1000μL，并配備與移液器匹配的吸頭。

c)高速臺(tái)式離心機(jī)：離心力≥12000g。

d)恒溫水浴鍋或金屬?。?00℃±1℃。

e)天平：感量0.01g。

7檢測(cè)程序

副溶血性弧菌實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)程序見(jiàn)圖１。

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圖1副溶血性弧菌實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)程序

8操作步驟

8.1樣品處理和增菌

水產(chǎn)品參照GB4789.7執(zhí)行。

8.2細(xì)菌模板DNA的制備

8.2.1試劑盒法

使用商品化DNA提取試劑盒，吸取適量獲得的增菌液，按其說(shuō)明提取制備模板DNA。

8.2.2煮沸法

8.2.2.1吸取10.1獲得的增菌液1mL菌液加入1.5mL離心管中，10000g離心1min，棄上清。

8.2.2.2加入1mL無(wú)菌水，充分懸浮沉淀，10000g離心1min，棄上清；

8.2.2.3加入100μL無(wú)菌水混勻后沸水浴（或95℃金屬?。?0min，置冰上冷卻；

8.2.2.410000g離心1min，上清液即為模板DNA。

8.3實(shí)時(shí)熒光RAA擴(kuò)增

8.3.1實(shí)時(shí)熒光RAA反應(yīng)體系

副溶血性弧菌RAA檢測(cè)，50μL反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

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表2副溶血性弧菌熒光RAA反應(yīng)體系

組分名稱(chēng)體積（μL）

20%PEG12.5μL

tlh-F(10μmol/L)2.1μL

tlh-R(10μmol/L)2.1μL

tlh-P(10μmol/L)0.6μL

DNA模板（20ng/μL）4.0μL

ddH2O26.2μL

MgAc2（280mmol/L）2.5μL

總量50μL

注：（1）DNA模板量可根據(jù)不同樣品，具體情況進(jìn)行調(diào)整。

（2）將除MgAc2和模板DNA以外的所有成分渦旋混勻，分裝混合液至含有凍干酶制劑的200μL反應(yīng)管中，輕

柔手彈使凍干粉充分重溶均勻，短暫離心，打開(kāi)反應(yīng)單元，向每個(gè)反應(yīng)單元的管蓋上加入2.5μLMgAc2，然后

向各反應(yīng)單元加入適量模板DNA（≤100ng），充分混勻并離心。

（3）可使用等效的商品化熒光RAA試劑盒按照其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

8.4反應(yīng)條件

將反應(yīng)管置于熒光檢測(cè)儀中，39℃恒溫，30min。在反應(yīng)過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)。

8.5實(shí)驗(yàn)對(duì)照

檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照?？瞻讓?duì)照以無(wú)菌水替代模板DNA；陰性對(duì)照

以非副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為模板DNA；陽(yáng)性對(duì)照以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802DNA

作為模板DNA。

9結(jié)果判定和報(bào)告

9.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

空白對(duì)照在30min內(nèi)無(wú)擴(kuò)增曲線；陰性對(duì)照在30min內(nèi)無(wú)擴(kuò)增曲線；陽(yáng)性對(duì)照在10min內(nèi)出現(xiàn)典型

的擴(kuò)增曲線。

以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿(mǎn)足，否則，本次實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行。

9.2結(jié)果判定

樣品在30min內(nèi)無(wú)擴(kuò)增曲線，可判定樣品結(jié)果為陰性，可直接報(bào)告未檢出副溶血性弧菌；樣品在30

min內(nèi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，則樣品結(jié)果為副溶血性弧菌初篩陽(yáng)性。對(duì)于初篩陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)參見(jiàn)GB4789.7進(jìn)行

確證后報(bào)告結(jié)果。

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