SNT 5364.3-2021 出口食品中致病菌檢測方法 微滴式數(shù)字PCR法 第3部分：溶藻弧菌-PDF解密

ICS07.100.30CCSX04中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T5364.3—2021出口食品中致病菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法第3部分:溶藻弧菌DropletdigitalPCRmethodfordetectionofpathogensinexportfood—Part3Vibrioalginolyticus2021-11-22發(fā)布2022-06-01實施中華人民共和國海關總署發(fā)布ⅠSN/T5364.3—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。SN/T5364—2021《出口食品中致病菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法》共分為8個部分:第1部分:副溶血性弧菌;第2部分:霍亂弧菌;第3部分:溶藻弧菌;第4部分:創(chuàng)傷弧菌;第5部分:金黃色葡萄球菌;第6部分:單核細胞增生李斯特氏菌;第7部分:產志賀毒素大腸埃希氏菌;第8部分:克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)。本文件為SN/T5364—2021的第3部分。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國海關總署提出并歸口。海關。1SN/T5364.3—2021出口食品中致病菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法第3部分:溶藻弧菌1范圍本文件規(guī)定了食品中溶藻弧菌的微滴式數(shù)字PCR檢測方法。本文件適用于食品中溶藻弧菌的快速定性檢測。本文件的檢出限為1CFU/25g~5CFU/25g(或1CFU/25mL~5CFU/25mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403—2008實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測NMKLNo.156食品致病性弧菌的檢測和計數(shù)(PathogenicVibriospeciesdetectionandenumer-ationinfoods)3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA(deoxyribonuleicacid):脫氧核糖核酸。ddPCR(dropletdigitalpolymerasechainreaction):微滴式數(shù)字PCR。PCR(polymerasechainreaction):聚合酶鏈式反應。5方法原理針對溶藻弧菌GroEL基因保守序列設計引物、探針,將一定濃度的引物、探針與模板DNA及數(shù)字PCR反應預混液混合,配成PCR反應體系。將該數(shù)字PCR體系分布到10000~20000個微滴中,使大部分微滴中模板DNA分子的數(shù)量為1或0,然后進行PCR擴增。GroEL基因探針5’端標記FAM熒光基團,利用數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測通道,可對每個微滴的熒光信號進行采集分析。含有模板DNA的微滴出現(xiàn)熒光信號的增強,形成陽性微滴簇。最終根據(jù)陽性微滴的有無判定樣品中是否含有溶藻弧菌。2SN/T5364.3—20216主要設備及耗材6.1天平:感量0.1g。6.2均質器。6.3恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。6.4高速臺式冷凍離心機(離心力12000g)。6.5渦旋振蕩儀。6.6核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.7生物安全柜。6.8ddPCR擴增儀及相關配套設備。6.9不同量程移液器:100μL~1000μL、20μL~200μL、10μL~100μL、0.5μL~10μL。6.10離心管:2mL、1.5mL和0.2mL。7材料與試劑7.1僅使用分析純試劑和符合GB/T6682規(guī)定的一級水。7.2細菌基因組提取試劑盒。7.3ddPCR反應配套試劑。7.4去游離核酸酶:伯樂1)。7.5陽性對照:溶藻弧菌標準菌株DNA,或含目的片段的DNA亦可。7.6溶藻弧菌GroEL基因特異性序列片段參見附錄A,引物探針如下:VA-F:5’-GAGCTTTCTGTTGAATGTAACGACAC-3’;VA-R:5’-ACCCACACGCTCCATTGC-3’;VA-P:FAM-TCTCTGCAAACTCAGACGCAAGCGTAGG-BHQ1-3’。8檢測程序食品中溶藻弧菌ddPCR檢測程序見圖1。1)給出這一信息是為了方便本文件使用者,并不表示只認可該產品。如果其他等效產品具有相同的效果,則可使用等效產品。3SN/T5364.3—2021圖1食品中溶藻弧菌ddPCR檢測程序9實驗操作步驟9.1樣品制備參照NMKLNo.156中的方法進行樣品制備和增菌。9.2DNA提取直接取9.1獲得的增菌液2mL加到無菌離心管中,8000g離心2min,盡量吸棄上清;利用100μL磷酸鹽緩沖液重懸沉淀,加入20μL去游離核酸酶,置于37℃作用15min~30min,95℃加熱10min使酶失活。繼而利用細菌基因組提取試劑盒提取DNA,操作方法按試劑盒說明書進行。9.3DNA濃度和純度測定取適量DNA原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測定260nm和280nm處的吸收值,按照式(1)計算DNA的濃度。ρ=A260×N×50…………(1)式中:ρ—DNA濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);A260—260nm處的吸光值;N—核酸稀釋倍數(shù)。當DNA濃度為0.1μg/mL~100μg/mL,A260/A280在1.8~2.0之間時,適用ddPCR檢測。4SN/T5364.3—20219.4ddPCR檢測9.4.1對照和平行檢測過程中分別設置陽性對照、陰性對照和空白對照。以溶藻弧菌標準菌株DNA或含目的片段的DNA作為陽性對照,利用細菌基因組提取試劑盒按步驟9.2提取的大腸埃希氏菌標準菌株DNA作為陰性對照,用等體積的雙蒸水代替DNA模板作為空白對照。每個待檢樣品提取的DNA溶液進行3個平行ddPCR檢測。9.4.2反應體系按照表1配置反應體系。表1ddPCR反應體系試劑名稱儲備液濃度終濃度體積數(shù)字PCR反應預混液2×1×10μLVA-F10μmol/L0.75μmol/L1.5μLVA-R10μmol/L0.75μmol/L1.5μLVA-P10μmol/L0.25μmol/L0.5μLDNA模板——5μL水——1.5μL體系總體積——20μL9.4.3微滴生成將配制好的數(shù)字PCR反應混合液,加入微滴生成裝置加樣孔中,按儀器操作說明生成微滴。9.4.4ddPCR擴增將生成的微滴緩慢轉移至96孔板中,封膜后置于PCR儀上,按以下參數(shù)進行PCR擴增:95℃10min(升降溫速度:1℃/s);94℃30s(升降溫速度:1℃/s),58℃1min(升降溫速度:1℃/s),45個循環(huán);98℃10min(升降溫速度:1℃/s),4℃保存反應產物。注:PCR反應參數(shù)可根據(jù)基因擴增儀型號的不同進行適當?shù)恼{整。9.4.5熒光信號讀取擴增反應結束后,將96孔板放入ddPCR檢測儀中對每個微滴進行熒光檢測,采用FAM通道讀取熒光信號。10結果分析與表述10.1閾值的設定根據(jù)空白對照的終點熒光值設定閾值限,閾值限應對空白和陽性擴增結果進行明確的區(qū)分。5SN/T5364.3—202110.2質量控制10.2.1體系分隔產生的有效微滴的總數(shù)量滿足所用ddPCR儀器型號要求。10.2.2陰性對照和空白對照無熒光信號檢出。10.2.3陽性對照有熒光信號檢出且陰性微滴簇與陽性微滴簇能夠截然分開。10.2.4以上質控條件有一項不符合者,實驗結果視為無效,查找原因后再次進行ddPCR檢測。10.3結果表述10.3.1待檢樣品所有微滴的熒光信號均低于閾值限,待測樣品中不含有溶藻弧菌,檢測結果表述為“未檢出溶藻弧菌”。10.3.2待檢樣品3個平行中至少1個平行有熒光信號高于閾值限的陽性微滴,且陰性微滴簇與陽性微滴簇能夠截然分開,該樣品結果為溶藻弧菌初篩陽性,對樣品的增菌液進一步按NMKLNo.156中的操作步驟進行確認后報告結果。11防污染措施檢測過程中防