內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)

凝膠法BET檢查技術(shù)湛江安度斯生物有限公司2009年3月5/8/20241內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)

1、凝膠法BET試驗(yàn)程序2、試驗(yàn)器具3、鱟試劑靈敏度復(fù)核4、干擾初篩試驗(yàn)5、干擾試驗(yàn)6、檢查法7、實(shí)驗(yàn)相關(guān)知識(shí)及技巧5/8/20242內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)1、凝膠法BET的實(shí)驗(yàn)程序試驗(yàn)準(zhǔn)備確定供試品的內(nèi)毒素限值選擇鱟試劑計(jì)算最大有效稀釋倍數(shù)或最低有效濃度鱟試劑靈敏度復(fù)核干擾初篩試驗(yàn)干擾試驗(yàn)日常檢查5/8/20243內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)2、試驗(yàn)器具試驗(yàn)器具的要求及處理玻璃器皿需經(jīng)除熱原處理，以除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用方法是玻璃器皿經(jīng)清洗后在>250℃至少干烤1小時(shí)塑料器械應(yīng)選用標(biāo)明無(wú)內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無(wú)干擾的器械首選硼硅酸鹽玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具5/8/20244內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)

孵育反應(yīng)儀器恒溫水浴箱干式恒溫儀5/8/20245內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)

孵育反應(yīng)溫度是鱟試驗(yàn)的重要條件參數(shù)之一現(xiàn)行法規(guī)對(duì)反應(yīng)溫度的要求較寬松(37±1℃)嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件是實(shí)驗(yàn)室水平的重要標(biāo)志之一80年代發(fā)達(dá)國(guó)家已使用干式恒溫儀取代水浴箱2000年版《中國(guó)藥典》BET法開(kāi)始接受干式恒溫儀TAL-40型試管恒溫儀的特點(diǎn)溫控精確：37±0.2℃發(fā)熱均勻：<0.1℃可定時(shí)及提示：0~90分鐘任意可設(shè)定時(shí)，到時(shí)蜂鳴提示試管免封口，無(wú)水蒸氣或水滴影響體積小巧，使用方便5/8/20246內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)3、鱟試劑標(biāo)示靈敏度的復(fù)核試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康尿?yàn)證實(shí)驗(yàn)室的條件是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)人員的操作技能是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用試劑（包括鱟試劑、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品、BET水等）是否滿足BET實(shí)驗(yàn)的要求5/8/20247內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)

實(shí)驗(yàn)步驟開(kāi)啟恒溫儀器預(yù)熱C溶液(標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液)的制備鱟試劑的準(zhǔn)備加樣及恒溫反應(yīng)結(jié)果判斷數(shù)據(jù)處理5/8/20248內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)操作步驟示意圖稀釋為2λ、λ、0.5λ、0.25λ內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(C溶液)0.1mlTAL＋0.1mlCSE(RSE)，平行4管NC：0.1mlTAL＋0.1mlBET水，平行2管單次管：原安瓿多次管：反應(yīng)試管輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁搖勻每步稀釋于旋渦混合器混合30秒旋渦混合器混合15min混勻混勻BET水復(fù)溶BET水復(fù)溶內(nèi)毒素RSE或CSE鱟試劑TAL37℃±1℃，孵育60min±2min混勻（水浴恒溫需封口）翻轉(zhuǎn)180度，觀察凝膠狀況5/8/20249內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)靈敏度復(fù)核試驗(yàn)舉例試劑試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支0.25EU/ml18內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水(W)安度斯50ml/瓶<0.003EU/ml15/8/202410內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)1）標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液C的制備0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s30s2.0ml100EU/ml0.4mlCSEBET水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml2.0ml3.6ml2.0ml2.0ml0.125EU/ml30s2.0ml2.0ml0.06EU/ml30s2.0ml2.0ml混合5分鐘5/8/202411內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)2）鱟試劑的準(zhǔn)備取0.1ml裝量，靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑18支，在安瓿頸部折斷，按照陰性對(duì)照溶液D兩支，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液每濃度平行4管排列：用精確移液器準(zhǔn)確吸取0.1mlBET水分別加入每支鱟試劑中，使鱟試劑全部溶解陰性對(duì)照溶液D0.06EU/ml0.125EU/ml0.25EU/ml0.5EU/ml5/8/202412內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)3）加樣用精確移液器分別吸取0.1ml的0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液C，加入復(fù)溶的鱟試劑中，每濃度平行4管，吸取0.1mlBET水（D溶液）加入另外兩支鱟試劑內(nèi)，作為陰性對(duì)照CSETAL0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.1ml0.06EU/ml0.1ml0.1mlBET水0.1ml加樣順序一般從低濃度到高濃度5/8/202413內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)4）恒溫反應(yīng)將加樣完的鱟試劑混合液輕輕搖勻（避免產(chǎn)生氣泡），放入37±1℃的恒溫器中孵育60±2分鐘（孵育過(guò)程中避免振動(dòng)影響凝膠形成）若恒溫裝置是水浴恒溫箱，那么在加樣后需將反應(yīng)管封口，避免水蒸氣進(jìn)入反應(yīng)管內(nèi)造成污染5/8/202414內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)5）結(jié)果判斷將反應(yīng)試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180℃，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為“＋”；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑脫者為陰性，記錄為“-”。＋＋＋＋－－－－陽(yáng)性陰性結(jié)果判斷：反應(yīng)管緩緩倒轉(zhuǎn)180o陽(yáng)性(+)：凝膠不變形，不從管壁滑脫者陰性(-)：凝膠不能保持完整，從管壁滑脫者試驗(yàn)符合要求的基本條件：

NC管全部陰性（－－）

2λ管全部陽(yáng)性（＋＋＋＋）

0.25λ管全部陰性（－－－－）5/8/202415內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)6）數(shù)據(jù)處理舉例λc=lg-1（ΣX/4）

=lg-1{[(－0.903)＋(－0.602)＋(－0.602)＋(－0.602)]/4}=0.210EU/ml即本批號(hào)鱟試劑的復(fù)核靈敏度（λc

）為0.21EU/ml藥典要求：當(dāng)λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度值。結(jié)論：本批TAL的靈敏度標(biāo)示值符合規(guī)定。0.125平行管內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(EU/ml)NC反應(yīng)終點(diǎn)濃度X（lg反應(yīng)終點(diǎn)濃度）0.50.250.061＋＋－－0.125－0.9032＋＋－－－0.25－0.6023＋＋－－－－0.6024＋＋－－－0.25－0.602＋0.255/8/202416內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)4、干擾初篩試驗(yàn)?zāi)康募霸肀驹囼?yàn)是藥品與鱟試劑相容性的篩選試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)一系列含2λ內(nèi)毒素濃度的樣品溶液與鱟試劑的反應(yīng)，初步篩選出對(duì)鱟試驗(yàn)無(wú)干擾的濃度本試驗(yàn)可減少干擾試驗(yàn)的盲目性5/8/202417內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)試驗(yàn)步驟供試品限值的確定供試品最大有效稀釋倍數(shù)的確定試劑的選擇反應(yīng)溶液的制備加樣及反應(yīng)結(jié)果判斷5/8/202418內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)干擾初篩試驗(yàn)舉例1）供試品限值硫酸慶大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；藥典要求，硫酸慶大霉素限值L=0.5EU/1000U5/8/202419內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)2）最大有效稀釋倍數(shù)的確定最大有效稀釋倍數(shù)MVD=cL/λ使用λ=0.5EU/ml靈敏度的鱟試劑時(shí)，MVD0.5

=因此可計(jì)算出使用不同λ時(shí)所對(duì)應(yīng)的MVD：0.5EU/ml20000U/ml×0.5EU/1000U靈敏度λ（EU/ml）0.50.250.1250.060.03對(duì)應(yīng)的MVD（倍）204080160320=20（倍）5/8/202420內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)3）試劑為了方便試驗(yàn)，干擾初篩試驗(yàn)中一般選擇靈敏度較低的鱟試劑作試驗(yàn)試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支0.25EU/ml24內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）

安度斯10ng/瓶10EU/ng1BET水（W）安度斯50ml/瓶<0.003EU/ml15/8/202421內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)4）各反應(yīng)溶液的制備溶液編號(hào)AD溶液內(nèi)容S20S40S80S160S320W平行管溶液編號(hào)BC溶液內(nèi)容S20E2λS40E2λS80E2λS160E2λS320E2λE2λ平行管5/8/202422內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)溶液C的制備E1000.4ml3.6mlWE100.4ml3.6mlWE10.5ml0.5mlWE0.5溶液C：E2λ溶液A的制備S原液0.4ml3.6mlWS101.4ml1.4mlWS201.4ml1.4mlWS401.4ml1.4mlWS801.4ml1.4mlWS1601ml1mlWS320溶液A備用液備用液5/8/202423內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)溶液B的制備E1S100.5ml0.5mlS20E0.5E1S200.5ml0.5mlS40E0.5E1S800.5ml0.5mlS160E0.5E1S1600.5ml0.5mlS320E0.5E1S400.5ml0.5mlS80E0.5溶液B：SE2λ注意事項(xiàng)：制備溶液C和B時(shí)，每一步的混合液需在旋渦混合器上混

合至少30秒。5/8/202424內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)5）加樣及反應(yīng)開(kāi)啟20支鱟試劑，分別用移液器準(zhǔn)確吸取0.1mlBET水將鱟試劑復(fù)溶取0.1ml相應(yīng)溶液C、B、A加入鱟試劑反應(yīng)管，每濃度平行2管另外取0.1mlBET水作為陰性對(duì)照溶液D加入鱟試劑反應(yīng)管。5/8/202425內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)6）結(jié)果判斷當(dāng)溶液A、D均為陰性；溶液C均為陽(yáng)性時(shí)，試驗(yàn)有效溶液B系列中，第一個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的濃度即初步將其判斷為樣品的無(wú)干擾濃度。本試驗(yàn)中的樣品無(wú)干擾濃度為≥S40

溶液編號(hào)AD溶液內(nèi)容S20S40S80S160S320W平行管溶液編號(hào)BC溶液內(nèi)容S20E2λS40E2λS80E2λS160E2λS320E2λE2λ平行管--++----------++++++--++5/8/202426內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)5、干擾試驗(yàn)通過(guò)比較鱟試劑與內(nèi)毒素在水溶液和供試品溶液中反應(yīng)的差異程度，來(lái)確定供試品在該濃度下是否對(duì)BET檢查有干擾。至少對(duì)3批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。5/8/202427內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)試驗(yàn)步驟供試品限值的確定鱟試劑的選擇最大有效稀釋倍數(shù)的確定反應(yīng)溶液的制備加樣及反應(yīng)結(jié)果判斷5/8/202428內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)1）供試品限值硫酸慶大霉素，20000U/ml；藥典要求內(nèi)毒素限值L=0.5EU/1000U2）試劑的選擇根據(jù)干擾初篩試驗(yàn)的結(jié)果，供試品在40倍稀釋（對(duì)應(yīng)鱟試劑靈敏度為0.25EU/ml）時(shí)無(wú)干擾一般不選擇第一個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果的供試品濃度作干擾試驗(yàn)。這里我們選擇靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進(jìn)行干擾驗(yàn)證試驗(yàn)。試劑名稱廠家規(guī)格標(biāo)示效價(jià)數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支0.125EU/ml36內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）

安度斯10ng/瓶10EU/ng（CoA）1BET（水）安度斯50ml/瓶<0.003EU/ml15/8/202429內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)3）最大有效稀釋倍數(shù)的計(jì)算MVD=cL/λ=80（倍）4）各反應(yīng)溶液的制備溶液編號(hào)CD溶液內(nèi)容E0.25E0.125E0.06E0.03W平行管溶液編號(hào)BA溶液內(nèi)容S80E0.25S80E0.125S80E0.06S80E0.03S80平行管5/8/202430內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)30s0.4ml0.12530s30s30s1000.4mlCSEBET水1.0ml100.50.251.8ml1.8ml1.8ml1.8ml1.8ml3.6ml1.8ml30s1.03.6ml0.0630s1.8ml1.8ml30s1.8ml1.8ml0.03(EU/ml)溶液C的制備CSE (E4λ)、E2λ、Eλ、E0.5λ、E0.25λ

（即E0.5

、E0.２5

、E0.125、

E0.06、

E0.03）稀釋溶液C混合5分鐘5/8/202431內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)溶液A的制備S原液0.3ml2.7mlWS101ml3mlWS400.6ml0.6mlWS80硫酸慶大霉素S0.3mlS102.7ml1.0ml3.0ml溶液A：S80BET水0.6ml0.6mlS405/8/202432內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)溶液B的制備E0.5S400.5ml0.5mlS80E0.25E0.25S400.5ml0.5mlS80E0.125E0.125S400.5ml0.5mlS80E0.06E0.06S400.5ml0.5mlS80E0.035/8/202433內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)5）加樣及反應(yīng)開(kāi)啟36支鱟試劑，先分別用0.1mlBET水復(fù)溶,再分別加相應(yīng)的溶液0.1ml（A、B、C和D）37±1℃反應(yīng)60±2分鐘0.25EU/ml(2λ)0.125EU/ml(λ)0.06EU/ml(?λ)0.03EU/ml(?λ)BET水S80E0.25(SE2λ)S80E0.125(SEλ)S80E0.06(SE?λ)S80E0.03(SE?λ)S805/8/202434內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)6）結(jié)果判斷反應(yīng)結(jié)果溶液編號(hào)C（Es系列）D溶液內(nèi)容E0.25

E0.125

E0.06

E0.03W平行管溶液編號(hào)B（Et系列）A溶液內(nèi)容S80E0.25

S80E0.125

S80E0.06

S80E0.03S80平行管－－－－－－－－－－－－－－－－－－－+++++++++++++++++5/8/202435內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)結(jié)果計(jì)算及判斷藥典規(guī)定：當(dāng)溶液A和溶液D（陰性對(duì)照）的所有平行管都為陰性，且0.5λ

≤

Es≤

2λ時(shí)，試驗(yàn)有效。當(dāng)0.5Es≤Et

≤2Es時(shí)，供試品在該濃度下無(wú)干擾。本試驗(yàn)：1）0.5λ=0.06，2λ=0.25 Es=0.125，0.5λ<Es<2λ，有效!2）0.5Es=0.06，2Es=0.25 Et=0.104，0.5Es<Et<2Es

，無(wú)干擾！結(jié)論：使用靈敏度λ=0.125EU/ml的鱟試劑對(duì)樣品(S)的80倍稀釋液(S80)作BET，無(wú)干擾。ES=lg-14(lg0.125)×4=0.125EU/mlEt=lg-1=0.104EU/ml(lg0.06)+(lg0.125)×345/8/202436內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)6、檢查法1)凝膠法限量試驗(yàn)反應(yīng)項(xiàng)目設(shè)置項(xiàng)目名稱供試品檢查供試品陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照溶液編號(hào)ABCD溶液內(nèi)容SSE2λE2λW平行管5/8/202437內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)試劑根據(jù)干擾試驗(yàn)結(jié)果，供試品在80倍稀釋，使用鱟試劑靈敏度為0.125EU/ml條件下，對(duì)BET無(wú)干擾本試驗(yàn)選擇TAL靈敏度為0.125EU/ml，供試品稀釋80倍檢查試劑名稱廠家規(guī)格靈敏度或效價(jià)數(shù)量TAL安度斯0.1ml/支0.125EU/ml8CSE安度斯10ng/支10EU/ng1BET水(W)安度斯50ml/瓶<0.003EU/ml1硫酸慶大霉素(S)——100ml/支20000U/ml15/8/202438內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)各反應(yīng)溶液制備S原液0.3ml2.7mlWS100.6ml1.8mlWS400.6ml0.6mlWS80E1000.4ml3.6mlWE100.4ml3.6mlWE11.6ml1.6mlWE0.50.6ml0.6mlWE0.25E0.5S400.6ml0.6mlS80E0.25溶液C溶液A溶液B5/8/202439內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)加樣及反應(yīng)開(kāi)啟8支鱟試劑，分別加0.1mlBET水復(fù)溶；再分別加入相應(yīng)的溶液，每濃度平行2管溶液D（W）溶液C（E0.25）溶液A（S80）溶液B（S80E0.25）各0.1mL各0.1mL各0.1mL各0.1mL5/8/202440內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)結(jié)果判斷當(dāng)需要復(fù)檢時(shí)，A溶液平行4管，若所有平行管均為陰性，則供試

品合格；否則不合格。溶液編號(hào)ABCD溶液內(nèi)容S80S80E0.25E0.25W試驗(yàn)有效合格不合格需復(fù)檢復(fù)檢合格復(fù)檢不合格++－－++++－－－+－－－－－－－+5/8/202441內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)2）凝膠法半定量試驗(yàn)編號(hào)內(nèi)毒素濃度/加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無(wú)/供試品溶液檢查用水1

2

4

8——

——

——

——2

2

2

2B2λ/供試品溶液12λ2C2λ/檢查用水檢查用水12482λ

1λ

0.5λ

0.25λ2

2

2

2D無(wú)/檢查用水——————注：A為不超過(guò)MVD并且通過(guò)干擾實(shí)驗(yàn)的供試品溶液，從通過(guò)干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)

開(kāi)始用檢查用水稀釋成1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過(guò)MVD。

B為2λ濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液A（供試品陽(yáng)性對(duì)照）

C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列

D為陰性對(duì)照反應(yīng)項(xiàng)目設(shè)置5/8/202442內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)凝膠半定量試驗(yàn)舉例試劑鱟試劑（TAL）0.06EU/ml內(nèi)毒素（CSE）10ng/瓶；10EU/ngBET水(W)50ml/瓶供試品(生理鹽水）L=0.5EU/ml凝膠半定量法一般選用靈敏度較高的鱟試劑5/8/202443內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)各反應(yīng)溶液的制備溶液C的制備將CSE稀釋成E0.125,E0.06,E0.03,E0.015濃度溶液溶液A的制備將供試品(S1)稀釋至2倍、4倍、8倍E0.1251.8ml1.8mlWE0.061.8ml1.8mlWE0.031.8ml1.8mlWE0.015S11.8ml1.8mlWS21.8ml1.8mlWS41.8ml1.8mlWS8E1.250.4ml3.6mlW5/8/202444內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)加樣及反應(yīng)溶液B的制備E1.25S10.2ml1.8mlS1E0.125近似稀釋法溶液ABCDS1S2S4S8S1E0.125E0.125E0.06E0.03E0.015W平行管

5/8/202445內(nèi)毒素凝膠法檢查技術(shù)結(jié)果判斷試驗(yàn)有效條件*溶液D：－－

*溶液B：＋＋

*溶液C：E0.125＋＋且E0.015－－（即0.5λ≤λc≤2λ）ABCDS1S2S4S8S1E0.12