掃描電鏡樣品的制備課件教學(xué)

第一節(jié)掃描電鏡樣品的常規(guī)制備技術(shù)冷凍斷裂粘樣或滴樣熏蒸固定干燥花粉、種子及孢子類樣品管道鑄型腔形器官取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢清洗菌類和組培細胞第1頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢一、取材即：獲取觀察材料。遵循五字原則：準、輕、小、凈、濃1.迅速準確：取材動作要快，部位要準確。方法：因材料而異，通過破碎、解剖、切割、分離、提純等手段，獲取樣品最佳觀察面。2.動作輕巧：保護好擬觀察面。解剖器械要鋒利，不能對材料施加鋸、擠、拉壓的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷凍斷裂法。3.厚度小：滿足觀察條件的最小體積，厚度為1~2毫米4.純凈防混雜：花粉、孢子類樣品注意防塵、防混雜5.懸浮液樣品要求合適的濃度：濃度太大造成樣品堆積；濃度小則檢出困難。第2頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢二清洗：1.完整的制樣程序中有三次清洗固定前清洗：洗去表面的灰塵、黏液等附著物，確保獲得清潔的觀察表面。

前固定后清洗：洗凈醛類固定液，以免戊二醛與鋨酸反應(yīng)而削弱鋨酸的固定效果。

脫水前的清洗：洗凈固定液，以免與脫水劑反應(yīng)產(chǎn)生沉淀影響觀察效果。第3頁/共25頁2.清洗液的類型與選擇：蒸餾水、生理鹽水、加酶清洗液等

選擇原則：清洗液的pH值、滲透壓、溫度應(yīng)該盡量接近樣品材料的生理值，以免樣品因環(huán)境突變而產(chǎn)生形變。植物材料：蒸餾水洗凈塵埃；動物材料：等滲生理鹽水、5%碳酸鈉或緩沖液洗去黏液等；游離細胞：用等滲的緩沖液清洗(精子、血細胞、微生物)；覆蓋大量黏液的樣品(胃黏膜)用低濃度的蛋白水解酶溶液洗；組織培養(yǎng)細胞：用相應(yīng)的培養(yǎng)液清洗；特殊樣品：如乳腺組織富含蛋白質(zhì)和脂類，分別用16%的甘油和20%乙醇浸泡清洗；表面附著蠟質(zhì)、角質(zhì)層的樣品：用有機溶劑脫蠟。

選擇方法：取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢第4頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢3.清洗方法：不同材料采用不同方法，靈活應(yīng)用（1）植物材料：根部水沖洗去泥土，地上部用水沖洗或滴洗。觀察氣孔狀態(tài)時應(yīng)注意清洗后取材時機。（2）較干凈的樣品：固定后20倍體積的清洗液輕搖，換液三次。（3）表面附著大量黏液的樣品：振蕩法或噴射瓶壁加壓沖洗。（4）游離細胞、微生物：離心法清洗。（5）超聲波清洗：用于表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜、凹陷、皺折多的樣品。樣品置清洗液中，超聲波清洗器內(nèi)清洗，必須控制功率（6）灌流清洗：觀察管腔內(nèi)壁結(jié)構(gòu)的樣品，避免血液、組織液凝聚而影響觀察效果。通過動脈注入清洗液，直到排出液變清為止。必須控制壓力清洗液與樣品混合搖勻低速離心（反復(fù)三次）第5頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢1.單固定：只用一種固定劑（通常戊二醛）固定的方法。2.熏蒸固定：固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲類樣品。用鋨酸蒸汽熏蒸固定0.5~1小時。3.雙固定：戊二醛(1~3h)—鋨酸(0.5~1h)4.冷凍固定：液氮超低溫快速冷凍可保存樣品的生活狀態(tài)。5.不固定：干種子、花粉、孢子類樣品。四、脫水：梯度系列脫水法。注意：根據(jù)材料性質(zhì)和大小而調(diào)節(jié)脫水時間。三、固定方法第6頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢五、干燥：指除去樣品中的殘存液體（水或脫水劑），使樣品中不含液態(tài)物質(zhì)的過程。原因：液態(tài)物質(zhì)脫離樣品表面時必須克服表面張力，其反作用力會使樣品表面結(jié)構(gòu)產(chǎn)生形變。1.自然干燥法：樣品中的水分或脫水劑在大氣中自然蒸發(fā)使樣品干燥。適宜樣品：花粉、孢子、種子、果殼、木質(zhì)纖維、骨骼；游離細胞類在脫水劑中自然干燥較好。特點：經(jīng)濟便捷。2.真空干燥法：含水分或脫水劑樣品置于真空干燥器內(nèi)，抽低真空使液態(tài)物質(zhì)揮發(fā)，使樣品干燥。特點：干燥速度快，效果與自然干燥法相近。3.冷凍干燥法：超低溫快速冷凍取材固定脫水制冷劑真空升華粘樣液氮、丙烷第7頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢樣品干燥法4.臨界點干燥法（criticalpiontdryingmethodCPD)(1)干燥原理：在密閉容器中加熱，使液態(tài)干燥劑變?yōu)闅鈶B(tài)，當氣態(tài)與液態(tài)物質(zhì)的密度相等時，相界消失。這時液態(tài)干燥劑的分子內(nèi)聚力為零，此時液體的表面張力系數(shù)為零(即臨界狀態(tài))。在臨界狀態(tài)下繼續(xù)對容器加熱，同時以一定速度排出氣體，直到排凈為止。這時樣品在無表面張力的臨界狀況下得以干燥。使干燥劑氣相與液相相等的溫度稱為該干燥劑的臨界溫度。使干燥劑氣相與液相相等的氣壓稱為該干燥劑的臨界壓強。加熱器CO2CO2↑第8頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢臨界點干燥法（2）常用干燥劑與中間劑：常用干燥劑：中間劑：既可以與干燥劑，又能與脫水劑相溶的液體，先置換脫水劑而后又被干燥劑所置換。常用中間劑：醋酸異戊脂，醋酸戊脂。干燥劑：在臨界點干燥器內(nèi)起臨界干燥作用的液體.液態(tài)CO2：,臨界溫度為31.1℃，臨界壓強72.8標準大氣壓。

F12：臨界溫度28.9℃

，臨界壓強38.1標準大氣壓。第9頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢(3)干燥步驟：第一步：中間劑置換脫水劑：2次/10~15分鐘；第二步：干燥劑置換中間劑：2次/10~15分鐘；第三步：干燥劑進入臨界狀態(tài)并維持臨界狀態(tài)排盡干燥劑。15~30min5~10℃15~20℃10~20min35~40℃5~10min固定脫水中間劑置換預(yù)冷樣品室樣品入樣品室注入液態(tài)CO2CO2汽化緩慢排氣直到排盡粘樣鍍膜CO2置換(4)注意事項：放置樣品前要預(yù)冷樣品室，以免過早汽化影響效果；必須保證干燥劑的純度以免污染樣品；控制排出氣體速度，必須保持在臨界狀態(tài)下排凈氣體；樣品室溫度回到室溫，壓力回到零后方可開取樣品；干燥好的樣品要防止回潮，要妥善保存。第10頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢5.有機溶劑干燥法利用某些有機溶劑凝固點較高的特性，對樣品進行干燥。常用有機溶劑：叔丁醇、乙腈、莰烯純水：結(jié)晶點為0℃，再結(jié)晶點為-130℃叔丁醇：凝固點為24~25.5℃，10℃時全部固化；莰烯：凝固點為40℃

干燥方法：固定脫水75%叔丁醇乙醇溶液100%叔丁醇100%叔丁醇冷凝固化真空干燥粘樣鍍膜10~15分鐘10~15分鐘浸沒樣品0~4℃第11頁/共25頁取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢六、粘樣利用粘接劑把樣品固定在樣品托上1.目的要求：保證樣品在樣品托上的穩(wěn)定性；增強樣品與樣品托之間的導(dǎo)電性，觀察時表面不造成電荷堆積而發(fā)生放電現(xiàn)象。2.常用粘接劑：銀粉導(dǎo)電膠、碳粉導(dǎo)電膠、雙面膠帶。3.粘樣方法：保護觀察面，導(dǎo)電膠：用于粘貼大塊樣品（組織塊）；雙面膠帶：用于花粉類細小易分散的樣品；不粘貼：細菌、血液等單細胞直接滴在樣品托上；膠水：果殼、種子等較大顆粒的樣品。第12頁/共25頁七、鍍膜:取材清洗固定脫水干燥粘樣鍍膜鏡檢在樣品以及樣品托表面同時噴鍍一層金屬膜要求：鍍膜必須薄而均勻，本身無結(jié)構(gòu)，能夠再現(xiàn)樣品表面的固有形態(tài)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。目的：改善生物樣品的導(dǎo)電性；提高二次電子的產(chǎn)額，改善圖像的反差、亮度、分辨率，從而改善了圖像的質(zhì)量；并增強了樣品的機械強度。1.離子濺射鍍膜法：金、鉑、金—鈀、鉑—鈀合金（1）鍍膜原理：0.5~3KV1×10-2Torr抽低真空，加負高壓，殘留氣體分子電離，撞擊靶金屬產(chǎn)生粒子，粒子受電場作用飛向陽極落在樣品表面。第13頁/共25頁應(yīng)用：微生物樣品的處理液體培養(yǎng)基的菌落固體培養(yǎng)基的菌落,先滴固定液刮下菌落8000離心2~5分鐘常規(guī)固定脫水干燥粘樣鍍膜細菌霉菌切割菌落戊二醛固定常規(guī)脫水干燥桿菌10μm球菌10μm曲霉20μm酵母菌5μm第14頁/共25頁第15頁/共25頁第二節(jié)特殊要求的掃描制樣技術(shù)——組織細胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察法切斷法：多孔組織掰開法：實質(zhì)性組織拉斷法：纖維組織簡易剖出法環(huán)氧樹脂割斷法：冷凍割斷法：管道鑄型法：腔形器官的立體構(gòu)架內(nèi)部結(jié)構(gòu)剖出法離子蝕刻法：利用離子流破壞作用，使樣品表面剝離，從而暴露出樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。第16頁/共25頁適用于多孔隙組織，如肺、脾等。1.切斷法：方法：干燥的樣品→雙刀切割→粘樣鍍膜→觀察新切面一、組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡易剖出法：第17頁/共25頁2.鑷子掰開法適用于肝臟等實質(zhì)性器官以及密度大的組織3.雙面膠帶拉斷法：方法：切痕→掰開→粘樣→鍍膜觀察適用于纖維組織、顆粒樣品方法：干燥→粘樣→拉斷→鍍膜觀察第18頁/共25頁二、環(huán)氧樹脂割斷法：環(huán)氧樹脂包埋樣品固化敲斷溶去樹脂干燥鍍膜觀察-80℃小錘敲擊刀背三、冷凍割斷法：常用二甲基亞砜(DMSO)冷凍割斷法取材固定清洗保護包埋固化斷裂融化保護液清洗干燥鍍膜觀察DMSO過渡，12.5%，25%，50%各20~30分鐘，緩沖液液氮冷卻敲擊斷裂50%DMSO第19頁/共25頁四、管道鑄型法為觀察腔形器官內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的立體構(gòu)筑和分布情況，而設(shè)計的制樣方法。鑄型劑注入官腔內(nèi)，待其固化成形后，用腐蝕劑去掉組織，從而使反映官腔真實情況的鑄型樣品保留下來，經(jīng)干燥鍍膜后觀察分析.插圖犬腎髓旁血管鑄型犬腎小葉間動脈腎髓質(zhì)血管分布腎小體球動脈葉間動脈出球小動脈第20頁/共25頁1.管道鑄型的技術(shù)條件：鑄型劑應(yīng)具有適當?shù)酿ざ龋合喈?0~50%的甘油黏度；鑄型劑成型后應(yīng)具有耐腐蝕，干燥不變形、脆裂、耐高溫；控制灌注壓力：100mmHg左右，與組織和鑄型劑有關(guān)。2.鑄型操作技術(shù)：（1）鑄型劑：聚氯乙烯、甲基丙烯酸、丙烯酸單體、樹脂類、工程塑料。60℃下進行半聚合，調(diào)節(jié)黏度適中。（2）器官處理：摘取新鮮器官，生理鹽水由動脈注入清洗，

1%戊二醛灌流固定，確保效果。（3）加入硬化劑：灌注前加入，10分鐘即可硬化。（4）灌注鑄型：控制注入壓力，確保完全注入而不變形。（5）樣品腐蝕清洗：10~20%的NaOH或20~