實(shí)驗(yàn)四-逆轉(zhuǎn)錄PCR-(RT-PCR)

5/6實(shí)驗(yàn)四逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?．了解用逆轉(zhuǎn)錄PCR法獲取目的基因的原理。2．學(xué)習(xí)和掌握逆轉(zhuǎn)錄PCR的技術(shù)和方法。【實(shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）過程利用模板變性，引物退火和引物延伸的多個(gè)循環(huán)來擴(kuò)增DNA序列。因?yàn)樯弦惠喌臄U(kuò)增產(chǎn)物又作為下一輪擴(kuò)增的模板，是一個(gè)指數(shù)增長(zhǎng)的過程，使其成為檢測(cè)核酸和克隆基因的一種非常靈敏的技術(shù)。一般經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使模板DNA擴(kuò)增達(dá)106倍。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA（complementDNA）合成（即RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT，reversetranscription）），同cDNA的PCR結(jié)合在一起的技術(shù)，提供了一種基因表達(dá)檢測(cè)、定量和cDNA克隆的快速靈敏的方法。由于cDNA包括了編碼蛋白的完整序列而且不含內(nèi)含子，只要略經(jīng)改造便可直接用于基因工程表達(dá)和功能研究，因此RT-PCR成為目前獲得目的基因的一種重要手段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、表達(dá)差異，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的基本原理（圖4.1）。首先是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下從RNA合成cDNA，即總RNA中的mRNA在體外被反向轉(zhuǎn)錄合成DNA拷貝，因拷貝DNA的核苷酸序列完全互補(bǔ)于模板mRNA，稱之為互補(bǔ)DNA（cDNA）；然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一鏈為模板，以四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）為材料，在引物的引導(dǎo)下復(fù)制出大量的cDNA或目的片段。在RT時(shí)，有3種引物可選擇（表4.1)。用1）和2）方法，理論上是擴(kuò)增的所有的cDNA，還要用此產(chǎn)物做PCR的模板繼續(xù)擴(kuò)增。如果用3）方法，先要去查它的序列，并用oligo等軟件設(shè)計(jì)引物。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個(gè)樣品檢測(cè)或克隆多個(gè)基因的mRNA時(shí)比較有用。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。而一步法RT-PCR具有其它優(yōu)點(diǎn)（表4.2），cDNA合成和擴(kuò)增反應(yīng)在同一管中進(jìn)行，不需要打開管蓋和轉(zhuǎn)移，有助于減少污染。還可以得到更高的靈敏度，最低可以達(dá)到0.1pg總RNA，因?yàn)檎麄€(gè)cDNA樣品都被擴(kuò)增。對(duì)于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特異性引物(GSP)起始cDNA的合成。由圖4.1不難看出，隨機(jī)引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的多個(gè)位點(diǎn)退火，產(chǎn)生短的，部分長(zhǎng)度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5'末端序列及從帶有二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn)錄酶不能復(fù)制的終止位點(diǎn)的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長(zhǎng)的cDNA，需要按經(jīng)驗(yàn)確定每個(gè)RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機(jī)引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應(yīng)體系。因?yàn)槭褂秒S機(jī)引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比隨機(jī)引物特異性高。它同大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA3'端所發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾雜交。因?yàn)閜oly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機(jī)引物相比，cDNA的數(shù)量和復(fù)雜度要少得多。因?yàn)槠漭^高的特異性，oligo(dT)一般不需要對(duì)RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進(jìn)行優(yōu)化。建議每20μl反應(yīng)體系使用0.5μgoligo(dT)。oligo(dT)12-18適用于多數(shù)RT-PCR?；蛱禺愋砸铮℅SP）對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機(jī)引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設(shè)計(jì)PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)GSP的設(shè)計(jì)。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴(kuò)增引物序列相同，或GSP可以設(shè)計(jì)為與反向擴(kuò)增引物的下游退火。已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣，可以插入到質(zhì)?；蚴删w中，為此，首先必需有適當(dāng)?shù)慕宇^(Linker)，接頭可以是在PCR引物上增加限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)片段，經(jīng)PCR擴(kuò)增后再克隆入相應(yīng)的載體；也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進(jìn)行擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)是要從小鼠肝臟組織中獲取Fas配體基因，F(xiàn)as配體(FasL)是一分子量約為40u的II型跨膜糖蛋白，屬TNF家族成員?；罨腡細(xì)胞可表達(dá)Fas和FasL，并通過Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，保持機(jī)體免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn)在部分癌細(xì)胞中FasL表達(dá)增強(qiáng)，并與腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們采用RT-PCR方法克隆FasL全長(zhǎng)cDNA并構(gòu)建其表達(dá)載體，可以為進(jìn)一步研究FasL的功能提供條件。在上下游引物的5’端分別加上了限制酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基（即HindIII和BamHI），以便可以通過雙酶切將目的片段定向的克隆到原核表達(dá)載體pGFPUv上（附錄圖4.3）。為了便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以用金屬螯和層析的方法分離和純化目的蛋白，我們改造了pGFPUv，在其上加了6×His標(biāo)簽?！緦?shí)驗(yàn)安排】1．第一天：試劑的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase處理（0.1%DEPC浸泡或高溫干烤）。2．第二天：進(jìn)行（一）逆轉(zhuǎn)錄和（二）PCR擴(kuò)增。3．第三天：進(jìn)行（三）瓊