第二章 基因工程課件

第二章基因工程

一、緒論1、什么是基因？如何分類？什么是基因表達(dá)？2、什么是基因工程？它產(chǎn)生的背景是什么？它的理論及意義是什么？第二章基因工程1、什么是基因？如何分類？什么是基因表達(dá)？

（1）、不少教科書給基因下的定義是：基因是脫氧核糖核酸（DNA）分子上的一個(gè)特定的片段?；颍菏且粋€(gè)含有特定遺傳信息的核苷酸序列（或核酸片段），它是控制生物性狀的功能和結(jié)構(gòu)單位。（2）、根據(jù)是否轉(zhuǎn)錄和翻譯功能可分三類：一類是既有轉(zhuǎn)錄功能又有翻譯功能的基因，這類基因是指編碼酶和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因及編碼阻蛋白的調(diào)節(jié)基因（統(tǒng)稱為蛋白質(zhì)基因）；這也是人類基因組計(jì)劃中所的功能基因（26383—39114個(gè)）。第二章基因工程第二類是只有轉(zhuǎn)錄功能而沒有翻譯功能的基因，包括編碼tRNA和rRNA的基因；第三類是既不轉(zhuǎn)錄也不翻譯的基因，包括啟動(dòng)基因、操縱基因、增強(qiáng)子等（有時(shí)也把它稱為調(diào)控基因）。（3）、所以基因表達(dá)不能說就是遺傳信息經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯從（DNA）傳蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_(dá)：是基因表現(xiàn)其生物功能所經(jīng)歷的一系列分子轉(zhuǎn)化和相互作用的過程。第二章基因工程2、什么是基因工程？它產(chǎn)生的背景是什么？它的理論及意義是什么？

（1）、基因工程：應(yīng)用DNA重組技術(shù)，按照人們的意愿，在基因水平上改變生物的遺傳性，創(chuàng)造新生物物種，通過工程化為人類提供有用產(chǎn)品及服務(wù)的技術(shù)。遺傳工程：是包括基因工程在內(nèi)的人工改造生物遺傳性的全部技術(shù)；DNA重組技術(shù)：是采用酶法，將不同來源DNA進(jìn)行體外切割與連接構(gòu)成雜種DNA分子：分子克?。褐饕侵窪NA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程。三者之間有關(guān)系。但是有不同。第二章基因工程（2）、一方面是科學(xué)發(fā)展的必然要求（當(dāng)時(shí)育種工作、癌等的治療都要求科技應(yīng)有所突破）；另一方面是有關(guān)基因結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)理論研究的重大突破和技術(shù)的必然結(jié)果。（3）、意義：基因重組技術(shù)使人類可以打破物種之間遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移交換的天然屏障；跨越生物遠(yuǎn)緣不能雜交的鴻溝，使人類有計(jì)劃、有目的地進(jìn)行在物種間甚至在動(dòng)物、植物、微生物之間的基因雜交，達(dá)到有選擇和定向性改變生物的基本性狀，或融合進(jìn)人們所需的優(yōu)良性狀，從而獲得新的生物制品或制造出新的物種。更為重要的是可以運(yùn)用基基因工程技術(shù)方法去了解基因的功能以及基因調(diào)控的機(jī)理等一系列理論問題。另外在人類基因圖譜繪制完成后，將有可能為人類征服各種疾病開辟新的途徑。第二章基因工程一、基因工程的基本工具基因工程的基本工具：工具酶、基因運(yùn)載體和受體細(xì)胞。（一）、工具酶：基因工程中所使用的酶類。1、限制酶：凡能識別和切割雙螺旋DNA分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶類，全稱是限制性核酸內(nèi)切酶或限制性內(nèi)切酶核酸。（1）、限制酶的命名：是根屬名和種名相結(jié)合的原則。如：來自Haemophilusaeygtius(埃及嗜血桿菌)的三種酶為：HaeⅠ、HaeⅡ、HaeⅢ;第二章基因工程HaemophilusinfluenzaeRd(流感嗜血桿菌)的三種酶為：HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ;HaemophilusinfluenzaeRf的三種酶為：HinfⅠ、HinfⅡ、HinfⅢ;當(dāng)同屬不同種的兩種菌名前兩個(gè)字母完全相同時(shí)，則其中一種的酶的符號改用種名詞頭后第一個(gè)字母（小寫）代替三字母中最后一個(gè)字母如：Haemophilusparainfluenzae的二種酶為：HpaⅠ、HpaⅡ;而Haemophilusparahaemolyticus的二種酶為：HphⅠ、HphⅡ。第二章基因工程（2）、限制酶的分類：第一型為單一多功能酶，由三種不同的亞基組成，輔因子為ATP、Mg2+及S-腺苷蛋氨酸，其甲基化位點(diǎn)與識別位點(diǎn)相一致，切割后產(chǎn)生的DNA片段5‘-末端去掉磷?；笮纬傻牧u基末端不能作為多核苷酸激酶磷酸化的底物，所以不宜作為工具酶。第二型限制酶由兩個(gè)相同的亞基組成，分子量在2-10萬道爾頓之間，僅具有限作用，輔助因子僅為Mg2+，識別位點(diǎn)具有旋轉(zhuǎn)對稱性，切割位點(diǎn)與識別一致，其底物為雙螺旋DNA。它是基因工程的理想工具酶。第二章基因工程第三型限制酶由兩種亞基組成，具有雙重功能，輔因子為ATP、Mg2+，也受S-腺苷蛋氨酸激活，但不是必需。具有特定識別順序，甲基化位點(diǎn)與識別位點(diǎn)相一致，其功能還有待研究。第二型限制酶的特點(diǎn)：（1）、具有很強(qiáng)的底物專一性，其底物只能是雙鏈DNA分子，對單鏈RNA及雙鏈DNA-RNA雜交分子均不起作用；（2）、具有很強(qiáng)的位點(diǎn)專一性，它的識別位點(diǎn)為4-7核苷酸序列，甲基化位點(diǎn)就是識別位點(diǎn)，識別位點(diǎn)也切割部位；第二章基因工程（3）、位點(diǎn)上核苷酸順序通常呈雙重螺旋結(jié)構(gòu)。其切割方式有三種：EcoRⅠ：5’—GAATTC—3’3’—CTTAAG—5’

5’—GAATTC—3’G—5’3’—CTTAAHindⅢ：5’—NAAGCTTN—3’3’—NTTCGA

NA—5’

5’—NAAGCTTN—3’3’—NTTCGANA—5’SmaⅠ：5’—CCCGGG—3’3’—GGG

CCC—5’5’—CCCGGG—3’3’—GGGCCC—5’

第二章基因工程(4)：影響限制酶活性的因素：底物的純度；DNA的甲基化程度；DNA分子結(jié)構(gòu)；反應(yīng)溫度；反應(yīng)緩沖液。終止限制酶反應(yīng)的方法：加熱失活，65℃保溫5分鐘；如是耐熱酶，則可用脲、SOS、及胍等變性劑使之失活。第二章基因工程2、DNA連接酶及T4-DNA連接酶問題：什么是連接酶？作用機(jī)理如何？兩種連接酶各有什么特點(diǎn)？能催化DNA片段5‘-磷酰基與3’-羥基形成磷酸二酯鍵的酶。T4-DNA連接酶是T4-噬菌體編碼的一種重要連接酶機(jī)理特點(diǎn)：DNA連接酶只能封T4-DNA連接酶閉缺口，而不能封閉裂口；只能連接粘性末端，不能連接平整末端。T4-DNA連接酶具能連接粘性末端，又能連接平整末端。但用量大。第二章基因工程（二）、基因工程載體和受體系統(tǒng)問題：什么是載體？如何分類？做為載體必須符合哪些條件？基因工程為什么要用載體？什么是受體、克隆和重組體（重組子）？載體：能將目的基因運(yùn)載進(jìn)生物細(xì)胞并在其中自我復(fù)制的遺傳因子。分類（P13）：做為載體必須符合哪些條件：在細(xì)胞中能自我復(fù)制，即本身是復(fù)制子—可繁殖性；具有一種或多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，并在此位點(diǎn)中插入外源基因片斷后，不影響其本身的復(fù)制功能——可利用性；在基因重組中有1—2個(gè)篩選標(biāo)記從而容易進(jìn)行選擇—具有便利性；分子小，多拷貝，安全性好，適應(yīng)性強(qiáng)，容易控制，便于表達(dá)待。第二章基因工程在基因工程中，載體一般是用天然質(zhì)?；虿《緸椴牧?，經(jīng)過人工改造或重新構(gòu)建而成，改造的目標(biāo)是增加它們作為無性繁殖的有效性及安全性。改造的內(nèi)容有（1）、質(zhì)粒改小，以增加有效的裝載量和拷貝數(shù)；1、質(zhì)粒載體（PlasmidUector）：問題：什么是質(zhì)粒載體？有何生物特征？做為理想的質(zhì)粒載體是哪一類？（1）、質(zhì)粒載體是染色體外能自我復(fù)制的雙鏈閉合雜環(huán)狀DNA分子。（2）、同學(xué)自學(xué)。（3）、類型：根據(jù)DNA分子中是否含有接合轉(zhuǎn)移基因分為接合型質(zhì)粒和非接合型質(zhì)粒；根據(jù)拷貝數(shù)多少可分為低拷貝“也稱為嚴(yán)緊型”和高拷貝“也稱為松馳型”質(zhì)粒。第二章基因工程第二章基因工程（4）、介紹PBR322質(zhì)粒：PBR322質(zhì)粒最早是由Boliver待人構(gòu)建，多年來廣泛采用并經(jīng)改進(jìn)，產(chǎn)生了更有用的質(zhì)粒載體。PBR322質(zhì)粒是大腸桿菌質(zhì)粒載體，有萬能質(zhì)粒載體之稱。它是由PSF2124、PMB8、PSC101三個(gè)親本質(zhì)粒經(jīng)過復(fù)雜的重組構(gòu)成的。PSF2124—帶有氨芐青霉素抗菌素基因（Ampr）；PMB8—帶有COELⅠ（大腸桿菌素因子）松馳型復(fù)制子；

PSC101—帶有一個(gè)四環(huán)素抗性基因（Tetr）。因此PBR322質(zhì)粒是一個(gè)帶有（Ampr）和（Tetr）標(biāo)記的松馳型質(zhì)粒載體。第二章基因工程2、噬菌體載體；3、病毒載體；受體：用于擴(kuò)增載體及目的基因的細(xì)胞。克?。耗康幕虻臄U(kuò)增過程。重組體（重組子）：攜帶重組DNA分子的受體細(xì)胞。對受體要求：

※對人體無害：※繁殖能力強(qiáng)、生長速度快、從而在短時(shí)間內(nèi)能產(chǎn)生大量的后代，得到大量的基因拷貝和產(chǎn)物；※

限制系統(tǒng)缺陷，對外來DNA不降解；

※

有蛋白質(zhì)的加工修飾能力。如糖基化、氨基化和磷酸化等。第二章基因工程第二章基因工程二、基因工程的基本操作程序基因工程是將一個(gè)基因片斷插入到一個(gè)載體中，構(gòu)成重組體，再導(dǎo)入宿營主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，即進(jìn)行無性繁殖。因此，任何DNA克隆都包括四個(gè)步驟：獲取載體裁DNA和目的基因——把目的基因和載體在體外連接——將人工構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增——選擇與鑒定重組的克隆。第二章基因工程第二章基因工程第二章基因工程（一）、目的基因的獲得問題：什么是目的基因？什么是外源基因？獲得目的基因的方法和原理是什么？目的基因：我們通常將哪些已被或要被分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNA片段，能編碼某一產(chǎn)物或控制某一性狀。第二章基因工程

外源基因：把插入到載體內(nèi)的那個(gè)特定的DNA片斷。關(guān)系：外源DNA不一定含有目的地基因。方法：1、物理法：原理是從幾個(gè)方面來利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C配對，A和T配對的特性差別，以達(dá)到生物基因分離目的基因的目的。（1）、密度梯度離心法：（2）、單鏈酶法：（3）、分子雜交法：2、化學(xué)法合成基因：第二章基因工程條件：已知某種基因的核苷酸序列或者根據(jù)某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列。缺點(diǎn)：反應(yīng)專一性不強(qiáng)，副反應(yīng)多，合成片段越長分離純度化困難，產(chǎn)率越低，而且合成能力有限一般局限于150-200bp。3、化學(xué)與酶促相結(jié)合的合成法（P20）：：第二章基因工程第二章基因工程4、從基因文庫（genelibrary）中分離基因基因文庫（genelibrary）：是指匯聚某一生物染色體所有DNA序列的重組DNA群體（轉(zhuǎn)化子群）。它是將一種生物的基因儲(chǔ)存在可以長期保存的重組體中?；蛱结槪菏且欢螏в蟹派湫曰蚍欠派涞衅渌愃品派湫詷?biāo)記的與待查基因或其鄰近區(qū)段的核苷酸順序互補(bǔ)的核苷酸片斷。第二章基因工程第二章基因工程第二章基因工程5、逆轉(zhuǎn)錄法：逆轉(zhuǎn)錄法即利用逆轉(zhuǎn)錄酶由mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的方法。主要是合成分子量大而又不知道其序列的基因。原因（P23）：方法：與目的基因的mRNA為模板——借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)雙鏈DNA分子，即cDNA（單鏈）——再在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA片斷——與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合后轉(zhuǎn)入受體菌——擴(kuò)增為cDNA文庫——采用適當(dāng)?shù)姆椒◤腸DNA文庫中篩選出目的基因。如家兔和從的珠蛋白質(zhì)基因等。：第二章基因工程第二章基因工程6、聚合酶鏈技術(shù)（PCR）聚合酶鏈技術(shù)（PCR）是1985年美國加利福尼亞的Mullis等到人開發(fā)的一項(xiàng)專利技術(shù)。第二章基因工程定義：是指在四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以單鏈DNA為模板與寡聚核苷酸為引物，經(jīng)DNA聚合酶催化合成DNA互補(bǔ)鏈的過程。PCR的操作體系中含有：雙鏈模板DNA（即目的基因）、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶；一對引物和合成時(shí)所需要的原材料（dNTP）方法：高溫變性（雙鏈模板DNA在900-950加熱30-120分鐘）；

低溫退火（50-60℃

）

適溫延伸（72℃）如此再重復(fù)循環(huán)，則目的DNA片段的數(shù)量就呈指數(shù)性擴(kuò)增。

第二章基因工程第二章基因工程第二章基因工程（二）、目的基因與載體DNA的連接問題：什么是基因重組？進(jìn)行基因重組前應(yīng)考慮哪些問題？基因重組常用的方法有哪些？基因重組：就是利用限制酶和其它一些酶類切割和修飾載體DNA和目的基因，將兩者連接起來，將目的基因插入到自我復(fù)制的載體內(nèi)，再轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。以期這種外源性的目的基因能在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)?？紤]的問題：必需結(jié)合研究目的基因的特性，認(rèn)真設(shè)計(jì)最終構(gòu)建的重組體；實(shí)驗(yàn)步驟要盡可能簡單易行；采用的方法要使重組體分子在連接混合物中占有較大的比例。第二章基因工程方法：1、插入滅活法：將外源基因插入選擇性標(biāo)記使其滅活的方法。優(yōu)缺點(diǎn)：是在連接反應(yīng)中，易產(chǎn)生載體及目的基因的環(huán)化作用，以及載體和目的基因自身聚合作用，影響雜合重組體。第二章基因工程第二章基因工程2、定向克隆法P26：將目的基因按正確的方向插入載體的方法。優(yōu)缺點(diǎn)：不產(chǎn)生自身環(huán)化現(xiàn)象，但載體和目的基因仍可產(chǎn)生線性聚合體。第二章基因工程第二章基因工程3、同聚物接尾法：在載DNA及目的基因兩端分別接上能相互配對的同一個(gè)堿基聚合單鏈的重組過程。第二章基因工程第二章基因工程優(yōu)缺點(diǎn)：對載體及外源DNA的切割部位無特殊的限制，具有任何末端的DNA及載體均可通過此法重組；載體與基因均不產(chǎn)生自身環(huán)化與線性聚合體；方法簡便、應(yīng)用范圍廣。若載體和目的基因中間存在裂口，則也可產(chǎn)生同聚作用，退火時(shí)將產(chǎn)生復(fù)雜而無感染力的重組分子，影響轉(zhuǎn)化率。4、雙接頭法：在目的基因兩端分別接上不同的化學(xué)聯(lián)接器，然后與載體同時(shí)用兩種不同的限制酶切割，再將切割產(chǎn)物連接的方法。方法：在T4-DNA連接酶的作用下—將不同聯(lián)接器聯(lián)接到目的基因的兩端——經(jīng)兩種不同的限制酶切割后，再與載體重組。第二章基因工程第二章基因工程5、平接法：具有3’-羥基和5’-磷酸?；钠侥┒薉NA片斷之間，在T4-DNA連接酶的作用下，形成共價(jià)結(jié)合的過程。優(yōu)缺點(diǎn)：是DNA重組中最簡單的一種方法，任何齊平末端外源DNA片段及載體之間均可以進(jìn)行重組。在基因工程中用途較大，對于沒有交錯(cuò)切割位點(diǎn)的外源DNA片段的重組，具有特別重要的意義。但反應(yīng)速度慢，僅為粘接法的1%，T4-DNA連接酶用量大，為粘接法的10-30倍。作業(yè)題：在重組實(shí)驗(yàn)中，如何防止或消除自身再環(huán)化作用和線性聚合體？影響連接效果的因素有哪些？第二章基因工程第二章基因工程（三）、重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞問題：體外構(gòu)建的重組DNA為什么要導(dǎo)入宿主細(xì)胞？P281、重組體DNA的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染：問題：什么是轉(zhuǎn)化？什么是轉(zhuǎn)染？兩者有何異同？什么是轉(zhuǎn)化率？什么是轉(zhuǎn)化頻率？轉(zhuǎn)化（transformation）：是一種外源DNA分子或片斷進(jìn)入受體細(xì)胞使后者獲得新的遺傳性狀的過程。轉(zhuǎn)染（transfection）：裸露的病毒DNA或RNA感染寄主細(xì)胞的過程。兩者之間的關(guān)系：兩者的不同是DNA的來源不同。而過程相同的，也就是說本質(zhì)上兩者之沒有根本的差別，所以習(xí)慣上人們往往也把轉(zhuǎn)染通稱為廣義的轉(zhuǎn)化。第二章基因工程轉(zhuǎn)化率：指轉(zhuǎn)化細(xì)胞占受體細(xì)胞的比例。轉(zhuǎn)化頻率：指在受體細(xì)胞過量的情況下，重組DNA所能獲得的轉(zhuǎn)化子的菌落數(shù)。影響轉(zhuǎn)化率的因素：第一，宿主限制-修飾系統(tǒng)的影響；第二，宿主細(xì)胞人工感受態(tài)形成率對轉(zhuǎn)化率有重大的影響；第三，重組DNA的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化率也有關(guān)；第四，外源基因與宿主染色體DNA的同源性與轉(zhuǎn)化率也有關(guān)；第五，轉(zhuǎn)化體系中重組DNA的濃度與純度對轉(zhuǎn)化率有一定的影響。第二章基因工程2、重組體DNA的體外包裝及入噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)：問題：什么是轉(zhuǎn)導(dǎo)？什么是體外包裝？體外包裝的基本原理和方法怎樣？轉(zhuǎn)導(dǎo)：以病毒為介導(dǎo)（載體）將遺傳物質(zhì)從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過程。在基因工程中，是指借助溫和噬菌體或病毒的感染作用將重組的DNA轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的過程。限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)：由溫和噬菌體和病毒DNA為載體構(gòu)成的重組DNA分子，經(jīng)體外包裝成完整的噬菌體或病毒顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。廣義轉(zhuǎn)導(dǎo)：任意DNA片斷或重組DNA分子經(jīng)體外包裝完整的噬菌體顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)。第二章基因工程所謂體外包裝：就是在體外將重組的DNA放置到噬菌體的外殼里，然后通過正常的噬菌體感染過程，將它們導(dǎo)入宿主細(xì)胞。體外包裝采用噬菌體感染過的大腸桿菌溶解液，也就是包裝提取物（packagingextract）進(jìn)行的。包裝提取物（packagingextract）包括：E蛋白：是噬菌體頭部的主要成分。D蛋白：位于噬菌體頭部外側(cè)并與噬菌體頭部成熟有關(guān)。A蛋白：與入噬菌體DNA插入頭部，與粘性末端形成有關(guān)。Z蛋白：是尾部的主要成分。得到包裝提取物的方法：第二章基因工程第二章基因工程第二章基因工程一種是雖然可以從入噬菌體直接提取到包裝蛋白，但是這種方法比較復(fù)雜，不能成為常規(guī)技術(shù)。另一種方法是采用E基因變異株和A基因變異株（E-和A-）或（E-和D-）的入噬菌體感染大腸桿菌。以入噬菌體作基因載體進(jìn)行基因克隆有以下優(yōu)點(diǎn)：具有很大的外源DNA包容能力，對外源基因的克隆效率高；有非常高的入重組回收率，特別是適用于建立基因庫；具有正性篩選性質(zhì)。第二章基因工程（四）、重組體克隆的篩選與鑒定問題：為什么要對重組體進(jìn)行篩選和鑒定？篩選的方法如何？原理如何？方法：遺傳檢測法、核酸雜交法、免疫化學(xué)法、物理檢測法和DNA順序法等。依據(jù)是根據(jù)載體體系、宿營主細(xì)胞的特征以及外源基因在受體細(xì)胞表達(dá)不同，即：直接篩選方法：是針對載體攜帶的某種標(biāo)記基因和目的基因而設(shè)計(jì)的篩選方法。特點(diǎn)是直接測定基因和基因表型。第二章基因工程間接篩選是不直接測定基因，而是利用其它方法，例如利用特異性抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用對重組體的篩選。1、利用表型特征篩選（遺傳檢測法）：表型是指機(jī)體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其它特征。這些特征一個(gè)是克隆載體提供的這是最主要的也是應(yīng)用最多的；另一個(gè)是插入的外源DNA序列提供的，相對來說數(shù)量較少。（1）、抗藥性標(biāo)記插入滅活篩選法：原理：特點(diǎn)：是一種簡便快速的方法。但有時(shí)由于試劑或操作規(guī)程方面的原因，自身環(huán)化的載體分子有時(shí)也會(huì)失去特定的遺傳標(biāo)記。第二章基因工程第二章基因工程（2）、?-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法：原理：優(yōu)點(diǎn)：是更為簡單的方法。2、利用插入序列提供的表形特征篩選。這種篩選要求：（1）、克隆的DMA片斷是一個(gè)完整的基因序列；（2）、而且能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。這無疑是一個(gè)很大局限，特別是對真核基因。3、利用核酸雜交技術(shù)篩選：從基因文庫中篩選帶有目的基因插入序列的克隆，最廣泛應(yīng)用的是核酸分子雜交技術(shù)。它是根據(jù)核酸雜交原理，利用基因探針撿測出培養(yǎng)平板上重組轉(zhuǎn)化體菌落的位置。故也稱為原位雜交技術(shù)或菌落（噬菌斑）雜交。第二章基因工程核酸雜交技術(shù)：用基因探針與樣品中的DNA或mRNA進(jìn)行雜交以檢測其中是否含有目的基因或目的mRNA存在的技術(shù)。原位雜交技術(shù)：讓含有重組體的菌落或是噬菌斑，由平板轉(zhuǎn)移到膜上并釋放DNA，變性并固定在膜上，再同DNA探針雜交的方法。方法：培養(yǎng)——影印——溶菌——固定——顯色——對號取菌。優(yōu)點(diǎn)：可以廣泛的應(yīng)用。特別是適合于大量群體的篩選。第二章基因工程第二章基因工程3、利用免疫學(xué)方法篩選：免疫學(xué)方法是間接篩選方法，也就是利用特異抗體與目的基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用進(jìn)行篩選的方法。第二章基因工程這種方法的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高、特別是適用于選擇不為宿主提供任何選擇標(biāo)記基因的篩選。（1）、放射性抗體檢測方法：原理：一種免疫血清含有IgG抗體，它們識別抗原分子的不同決定簇，并分別與各自的抗原決定簇相結(jié)合?？贵w分子或抗體的F（ab）部分能夠牢固地吸附在固體基質(zhì)（例如聚已烯等塑料制品）上。而不會(huì)被洗脫掉，通過體外碘化作用，IgG抗體便會(huì)被放射性同位素125I標(biāo)記上。方法：培養(yǎng)——影印——裂菌——覆蓋——處理——獲取所需的重組克隆。第二章基因工程第二章基因工程（2）、免疫沉淀檢測法這種方法相對于放射性免疫法來講，靈敏度要低，而且易受干擾。但是它的價(jià)值在于操作簡便易行。方法：在生長菌落的瓊脂培養(yǎng)基中，加入專門抗這種蛋白質(zhì)分子的特異性抗體。如果有些菌落的細(xì)胞能分泌出目的蛋白，就會(huì)在它的周圍出現(xiàn)一條叫做沉淀素的抗原-抗體沉淀物所形成的白色園圈。這種方法的缺點(diǎn)是只能檢測分泌出細(xì)胞的蛋白質(zhì)，這就限制了該法的應(yīng)用。要用來檢測非分泌的蛋白質(zhì)，需要對該法進(jìn)行改良。第二章基因工程第二章基因工程4、轉(zhuǎn)譯篩選法概述：在基因工程中。通過基因重組，篩選的最終目的是獲得高表達(dá)的基因工程細(xì)胞，通過工程化生產(chǎn)有用的物質(zhì)。因此所獲得的重組體能否表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物是關(guān)鍵的問題。采用相應(yīng)的技術(shù)檢查工程細(xì)胞目的產(chǎn)物表達(dá)情況是直接最有效的手段。目前用于檢查工程細(xì)胞目的產(chǎn)物表達(dá)情況的轉(zhuǎn)錄-翻譯系統(tǒng)有：（1）、小細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)：原理：某些大腸桿菌在生長過程中能產(chǎn)生含重組質(zhì)粒而不含宿主DNA的無生命小泡稱為小細(xì)胞。如果小細(xì)胞中含有重組質(zhì)粒，則合成的蛋白質(zhì)是重組質(zhì)粒所編碼的，故可用于檢測重組質(zhì)粒表達(dá)情況。第二章基因工程方法：將重組DNA轉(zhuǎn)化到能產(chǎn)生小細(xì)胞的大腸桿菌中，——通過選擇與培養(yǎng)即可獲得含重組DNA小細(xì)胞——用速度沉降法離心，分離出小細(xì)胞——如果表達(dá)的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，則在反應(yīng)體系中加入35S-met及其它的氨基酸原料，即合成蛋白質(zhì)——然后將合成的產(chǎn)物用SDS-PAG電泳分析，并進(jìn)行自顯影——就可以檢測重組質(zhì)粒表達(dá)情況（如產(chǎn)物的種類、大小與相對含量）。：第二章基因工程第二章基因工程第二章基因工程（2）、大細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)應(yīng)用紫外線多次照射含重組DNA的大腸桿菌細(xì)胞，細(xì)胞生長停止，染色體不能復(fù)制和蛋白質(zhì)合成終止。這種狀態(tài)的細(xì)胞稱為大細(xì)胞系統(tǒng)。方法與小細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)相同。第二章基因工程（3）、無細(xì)胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)：無細(xì)胞體系是一種具有高水平翻譯能力的體外合成反應(yīng)系統(tǒng)。這是由具有高水平翻譯能力的動(dòng)、植物及微生物細(xì)胞制備的。如大腸桿菌、小麥胚、玉米胚、果蠅等。無細(xì)胞合成體系的成分相當(dāng)復(fù)雜，其中含有RNA聚合酶、核糖體、tRNA及能合成系統(tǒng)。還需要加入各種氨基酸、磷酸肌酸激酶、磷酸肌酸、無機(jī)離子及還原劑等。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入重組DNA及35S-Met后即可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。合成重組DNA編碼的蛋白質(zhì)，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAG電泳，自顯影以及水解后指紋圖譜分析，即可判斷目的基因的表達(dá)結(jié)果。第二章基因工程5、物理篩選法（1）、電泳篩選法：原理：根據(jù)帶有插入片段的重組體DNA在分子量會(huì)有增加，然后分離質(zhì)粒DNA并測定其分子長度，是一種直接的方法。優(yōu)點(diǎn)：比抗藥性插入失活平板篩選法更進(jìn)一步。（2）、R-環(huán)檢測法：原理：R-環(huán)指的是RNA通過取代與其序列一致的DNA鏈與雙鏈雜交，被取代的DNA單鏈與RNA：DNA雜交雙鏈所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。由于雜交雙鏈DNA：RNA分子比雙鏈DNA：DNA分子更為穩(wěn)定。那么將RNA及DNA相互混合，創(chuàng)造接近DNA變性的條件，RNA便會(huì)同它的雙鏈DNA中的互補(bǔ)序列退火形成穩(wěn)定的DNA：RNA雜交分子，而使被取代的另一條鏈處于單鏈狀態(tài)。R-環(huán)一旦形成就十分穩(wěn)定，而且在電子顯微鏡下可以觀察到。處理：在百分之70的酰胺緩沖溶液中接近變性溫度。第二章基因工程第二章基因工程第二章基因工程五、目的基因的表達(dá)與調(diào)控問題：1、目的基因表達(dá)必須具備怎樣的條件？

2、制約目的基因表達(dá)式的因素是什么？

3、什么是表達(dá)體系？第二章基因工程1、目的基因表達(dá)必須具備怎樣的條件？概述：不論基因工程的研究目的如何，最終均涉及到目的基因的表達(dá)問題。絕大多數(shù)的基因工程研究是以獲得基因表達(dá)產(chǎn)物為目標(biāo)。此外，有時(shí)基因工程的目的是研究基因結(jié)構(gòu)與機(jī)能的關(guān)系，進(jìn)行這種研究時(shí)，需要將天然的或人工突變的基因片斷插入含有一定報(bào)告基因的載體的適當(dāng)部位，比較天然基因與突變基因?qū)Ρ磉_(dá)水平的影響，從而分析目的基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。那么基因表達(dá)必須符合下列條件：（1）、基因的密碼區(qū)不能被插入序列所中斷：（2）、基因必須在啟動(dòng)子的控制之下，而啟動(dòng)子必須被宿主細(xì)胞的RNA聚合酶有效地識別；第二章基因工程

（3）、mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定，并且被有效轉(zhuǎn)譯。產(chǎn)生外源的蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞的蛋白酶所水解。2、制約目的基因表達(dá)式的因素是什么？外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與否以及表達(dá)水平受到很多因素的制約，其中主要有：（1）、外源基因是否插入在正確的閱讀框架；（2）、目的基因的有效轉(zhuǎn)錄（啟動(dòng)子的作用）；（3）、mRNA的有效翻譯（如S—D序列等作用）；（4）、轉(zhuǎn)錄后，翻譯后的適當(dāng)?shù)男揎椇图庸み^程等。這些因素在不同的表達(dá)體系又是不同的，這種不同不但與基因的來源、基因的性質(zhì)有關(guān)，而且與載體和受體細(xì)胞有關(guān)。第二章基因工程所謂閱讀框架：是由每三個(gè)核苷酸為一組聯(lián)接起來的編碼序列。外源目的基因自己必須置于正確性的閱讀框架之中，也就是說外源基因只有在它與載體上DNA的起始密碼相吻合時(shí)，才算是處于正確的閱讀框架之中。所謂啟動(dòng)子：是指一段DNA序列，它能指導(dǎo)RNA聚合酶連接在DNA模板上，并開始合成mRNA。不同的啟動(dòng)子效率不同，強(qiáng)的啟動(dòng)子指導(dǎo)產(chǎn)生較多的mRNA，弱啟動(dòng)子指導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄合成mRNA很少。啟動(dòng)子有明顯的特點(diǎn)：每個(gè)啟動(dòng)子序列都有兩個(gè)高度保守的區(qū)域。即保守序列（原核DNA鏈能被外切酶水解，唯獨(dú)啟動(dòng)子區(qū)有一區(qū)核苷酸對抗被水解而保持完整序列，這一區(qū)RNA聚合酶的結(jié)合得到保護(hù)，故名）第二章基因工程第二章基因工程

另外，外源基因要在宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，除了有強(qiáng)的啟動(dòng)子外還要在翻譯過程要求合適的條件。例如在mRNA鏈上要有一個(gè)可利用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以確保mRNA能被有效翻譯。在原核生物中，mRNA分子上有兩個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)：一個(gè)是起始密碼子（AUG或CUC），另一個(gè)是起始密碼子上游3—11bp處的3—9bp的序列稱為S—D序列。S—D序列與大腸桿菌中rRNA的16S亞基未端序列是互補(bǔ)的，通過互補(bǔ)作用，核糖體與mＲＮＡ鏈連接起來，開始翻譯過程。那么影響翻譯的因素主要有：（１）、S—D序列與rRNA的16S亞基３’未端 序列之間的互補(bǔ)程度是影響翻譯的主要因素； 第二章基因工程（2）、起始密碼子AUG與S—D序列之間的距離以及S——D序列的核苷酸組成也影響翻譯能力；（3）、起始密碼之后的第一個(gè)核苷酸對mRNA與核糖體的結(jié)合也有影響；（4）、基因末端的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的影響。外源基因末端要安裝好啟動(dòng)子，還要注意到終止區(qū)的設(shè)計(jì)。否則轉(zhuǎn)錄的表達(dá)的過程可能會(huì)：第一是轉(zhuǎn)錄與翻譯物不必要地加長，增加了細(xì)胞能量的消耗，產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)；第二是轉(zhuǎn)錄可能形成不理想的二級結(jié)構(gòu)，從而降降低了翻譯的效率；第三是可會(huì)發(fā)生啟動(dòng)堵塞現(xiàn)象，也就是從克隆基因的啟動(dòng)了開始轉(zhuǎn)錄可能于擾另一個(gè)重要基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。第二章基因工程第二章基因工程3、什么是表達(dá)體系？所謂表達(dá)體系：是由目的基因、表達(dá)載體與宿主細(xì)胞組成的完整系統(tǒng)。分為原核表達(dá)體系和真核表達(dá)體系。原核宿主系統(tǒng)是最早開發(fā)的基因表達(dá)系統(tǒng)，業(yè)已證明在合適的調(diào)節(jié)控制下，通過調(diào)整基本條件，做出正確設(shè)計(jì)，任何來源的基因都可以在原核宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。盡管如此，利用真核細(xì)胞作宿主表達(dá)系統(tǒng)還是具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：真核細(xì)胞能識別和除去外源基因的內(nèi)含子，切接加工形成成熟的mRNA，也就是說真核細(xì)胞帶內(nèi)含子的天然基因是可以利用的，這是原核細(xì)胞辦不到的；真核細(xì)胞將表達(dá)的蛋白質(zhì)糖基化，而大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)是沒有糖基化的，糖基化對于某些蛋白質(zhì)（如乙肝疫苗）的免疫原性影響很大。第二章基因工程真核細(xì)胞作為宿主表達(dá)系統(tǒng)尚存在以下幾個(gè)問題：一是選擇標(biāo)記及選擇系統(tǒng)只有少數(shù)幾個(gè)；二是轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的效率低，一般只有10-6—10-4；三是外源基因轉(zhuǎn)移并整合到細(xì)胞染色體DNA上帶有一定的自發(fā)性和盲目性，整合的拷貝數(shù)和位置都不能控制；四是細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇要求比較高，手續(xù)繁瑣且費(fèi)時(shí)。此外，細(xì)胞培養(yǎng)還有不少問題，而且成本較高，利用培養(yǎng)細(xì)胞方式大量生產(chǎn)某些表達(dá)蛋白質(zhì)，從式藝到成本都需要很好的考慮。第二章基因工程當(dāng)前，利用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)制品主要以原核細(xì)胞為受體細(xì)胞，用發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)。下面以大腸桿菌為例來說明原核表達(dá)體系：在腸桿菌是基因工程采用最多的蛋白質(zhì)表達(dá)體系，原因是；培養(yǎng)方法簡單、迅速、經(jīng)濟(jì)又易于掌握，再加上人們運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)外源基因有二十多年的經(jīng)驗(yàn)。運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)外源基因，必須采用符合以下條件的載體：（1）、含大腸桿菌適宜的選擇標(biāo)記；（2）、具有能控制轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量mRNA的啟動(dòng)子。如lac（是控制lacz基因轉(zhuǎn)錄的序列，編碼

-半糖苷酶）和tac（由trp啟動(dòng)子與Lac啟動(dòng)子雜合而成，但比二者更強(qiáng)，并仍可被IPTG誘導(dǎo)）。第二章基因工程（3）、含適當(dāng)?shù)姆g調(diào)控序列如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯起始點(diǎn)；（4）、具有多聚接頭。大腸桿菌表達(dá)體系的缺點(diǎn)：（1）、表達(dá)的真核蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B或糖基化修飾；（2）、表達(dá)的蛋白質(zhì)常常形成不溶性包涵體，要使具有活性還需要經(jīng)復(fù)性等處理；（3）、很難大量表達(dá)分泌性蛋白質(zhì)。這樣就使得原核基因表達(dá)受到限制。因此開發(fā)適合的真核基因的表達(dá)體系將會(huì)使基因在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用變得更廣泛，更有實(shí)際意義。第二章基因工程真核細(xì)胞表達(dá)體系的特點(diǎn)：1）、由于真核細(xì)胞內(nèi)具有一系列剪切酶，外源基因的內(nèi)含子可以被自動(dòng)剪除真核細(xì)胞，并成功表達(dá)目的多肽。它不象原核細(xì)胞表達(dá)體系那樣必須從mRNA制備DNA；2）、真核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，其S—D序列與細(xì)胞核糖體rRNA16S亞基3|’末端的互補(bǔ)程度高，對翻譯水平的調(diào)節(jié)有利；3）、在真核細(xì)胞內(nèi)，由外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可被糖基化，可為糖蛋白，有利于保持或提高免疫原性；4）、外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的效率較低，其在染色體DNA上的整合是隨機(jī)的和自發(fā)的，目前還無法控制整合的位置和適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；第二章基因工程5）、真核細(xì)胞的培養(yǎng)要求較高，大量生產(chǎn)比較困難，成本也高。目前做為真核表達(dá)載體的代表是酵母表達(dá)體系，酵母表達(dá)體系是最重要真核表達(dá)體系。特點(diǎn)是酵母基因組較小，只是大腸桿菌的4倍，增殖一代所需的時(shí)間也只要幾個(gè)小時(shí)。因此，像原核細(xì)胞那樣易于操作，又可以用于真核細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜現(xiàn)象的研究。并已成功地用于人的干擾素和乙型肝炎疫苗，組織型血纖維蛋白溶源激活因子，胰島素和水蛭素的表達(dá)生產(chǎn)。目前盡管已開發(fā)出很多酵母，但釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母仍然是主要用于大規(guī)模蛋白質(zhì)生產(chǎn)的酵母，釀酒母是最好的宿主細(xì)胞，并且是遺傳上安全的生物，可以應(yīng)用或裝配很多類型的載體。第二章基因工程使用酵母表達(dá)體系應(yīng)注意以下方面：1）、由于釀酒酵母不能識別和處理高等其核的內(nèi)含子、故必須使用cDNA；2）注意所表達(dá)蛋白質(zhì)的性質(zhì)，因?yàn)檫@將決定在胞內(nèi)表達(dá)還是向外分泌；3）啟動(dòng)子和終止子的選擇；4）表達(dá)盒的穩(wěn)定性（有效的啟動(dòng)序列，目的蛋白cDNA和轉(zhuǎn)錄終止序列）；5）、外源蛋白的積累部位。第二章基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞能生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)。這種體系優(yōu)越性是：它表達(dá)的高等真核蛋白總是正確地被修飾，這種修飾包括二硫鍵的精確形成、糖基化、磷酸化、寡聚體的形成或者由特異性蛋白酶進(jìn)行的裂解等等，這些加工在原核細(xì)胞是做不到的。如果所表達(dá)的是具有生物功能的膜蛋白或分泌性蛋白，如細(xì)胞表面的受體或細(xì)胞外的激素或酶，那么更只能由哺乳動(dòng)細(xì)胞來表達(dá)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)幾乎總是在恰當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)一定區(qū)域累積。第二章基因工程缺點(diǎn)：是組織培養(yǎng)技術(shù)要求高；培養(yǎng)和篩選一個(gè)高度擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，通常要數(shù)月時(shí)間，難度較大。但這樣的細(xì)胞一經(jīng)產(chǎn)生，即可在液氮中較長久的保存。作業(yè)題：如何提高克隆基因表達(dá)效率？第二章基因工程生長激素釋放抑制因子基因式