顯微鏡直接計(jì)數(shù)法-3可編輯

驗(yàn)——微生物細(xì)胞大小的測(cè)定和顯微鏡直接計(jì)數(shù)錄入時(shí)間:2011-4-139:35:15來源：天津農(nóng)學(xué)院精品課程目的1.1

學(xué)習(xí)接目測(cè)微計(jì)的校正方法，

了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和計(jì)數(shù)原理1.2

學(xué)習(xí)使用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)定微生物細(xì)胞大小，

掌握用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物細(xì)胞總數(shù)的方法。2

原理微生物細(xì)胞的大小是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。微生物個(gè)體微小，必須借助于顯微鏡才能觀察，要測(cè)量微生物細(xì)胞大小，也必須借助于特殊的測(cè)微計(jì)在顯微鏡下進(jìn)行測(cè)量。顯微測(cè)微計(jì)由鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)和目鏡測(cè)微計(jì)兩部分組成。后者可直接用于測(cè)量細(xì)胞大小。它是一塊圓形玻片(圖7—1)，其中央有精確等分到度，測(cè)量時(shí)將其放在接目鏡中的隔板上。由于目鏡測(cè)微計(jì)所測(cè)量的是微生物細(xì)胞經(jīng)過顯微鏡放大之后所成像的大小，刻度實(shí)際代表的長度隨使用的目鏡和物鏡放大倍數(shù)及鏡筒的長度而改變，所以，使用前須先用鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)進(jìn)行標(biāo)定，求出某一放大率下，目鏡測(cè)微計(jì)每一小格所代表的長度，然后用目鏡測(cè)微計(jì)直接測(cè)被測(cè)對(duì)象的大小。鏡臺(tái)測(cè)微計(jì)是一塊中央有精確刻玻片(圖7—1)，刻度的總長為lmm，等分為100小格，每小格長10um，專用于對(duì)目鏡測(cè)微計(jì)進(jìn)行標(biāo)定的。3

材料3.1

器械顯微鏡、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺，載玻片、蓋玻片、血球計(jì)算板、擦鏡紙、吸水紙、玻片架、腎形盤、洗瓶、接種環(huán)、酒精燈、火柴、滴管。3.2

菌種培養(yǎng)48h的啤酒酵母斜面菌體和菌懸液。3.3

革蘭氏染液4流程4.1

置目測(cè)微計(jì)→置臺(tái)測(cè)微計(jì)→標(biāo)定目測(cè)微計(jì)→測(cè)菌體大小→記錄結(jié)果→用畢擦拭干凈4.2

檢查計(jì)數(shù)板→稀釋樣品→加樣→計(jì)數(shù)→計(jì)算→清洗5

步驟5.1

微生物菌體大小的測(cè)定5.1.1

目鏡測(cè)微尺的校正

更換目鏡鏡頭

更換目鏡測(cè)微尺鏡頭（標(biāo)記為PF）；或者取下目鏡上部或下部的透鏡，在光圈的位置上安上目鏡測(cè)微尺，刻度朝下，再裝上透鏡，制成一個(gè)目鏡測(cè)微尺的鏡頭。

某一倍率下標(biāo)定目鏡刻度將鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，使刻度面朝上，先用低倍鏡對(duì)準(zhǔn)焦距、看清鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器使兩尺重疊，并使二尺的左邊的某一刻度相重合，向右尋找另外二尺相重合的刻度。記錄兩重疊刻度間的目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)(圖7-1C)。

計(jì)算該倍率下目鏡刻度

目鏡測(cè)微尺每格長度=鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)/目鏡測(cè)微尺格數(shù)xl0um

標(biāo)定并計(jì)算其他放大倍率下的目鏡刻度以同樣方法分別在不同倍率的物鏡下測(cè)定目鏡測(cè)微尺每格代表的實(shí)際長度。如此測(cè)定后的測(cè)微尺的長度，僅適用于測(cè)定時(shí)使用的顯微鏡以及該目鏡與物鏡的放大倍率。5.1.2

菌體大小的測(cè)定

將啤酒酵母制成水浸片。

大小換算將標(biāo)本先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測(cè)微尺測(cè)定每個(gè)菌體長度和寬度所占的刻度，即可換算成菌體的長和寬。5.1.2一般測(cè)量微生物細(xì)胞的大小，用同一放大倍數(shù)在同一標(biāo)本上任意測(cè)定l0一20個(gè)菌體后，求出其平均值即可代表該菌的大小。5.2

用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定微生物細(xì)胞的數(shù)量5.2.1

檢查血球計(jì)數(shù)板

取血球計(jì)數(shù)板一塊，先用顯微鏡檢查計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，看其是否沾有雜質(zhì)或干涸著的菌體，若有污物則通過擦洗、沖洗，使其清潔。鏡檢清洗后的計(jì)數(shù)板，直至計(jì)數(shù)室無污物時(shí)才可使用。5.2.2

稀釋樣品將培養(yǎng)后的酵母培養(yǎng)液振蕩振搖混勻，然后作一定倍數(shù)的稀釋。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數(shù)為宜。一般以每小格內(nèi)含4～5個(gè)菌體的稀釋度為宜。5.2.3

加樣取出一塊干凈蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板中央。用滴管取1滴菌稀釋懸液注入蓋玻片邊緣，讓菌液自行滲入，若菌液太多可用吸水紙吸去。靜置5—10分鐘。5.2.4

鏡檢待細(xì)胞不動(dòng)后進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)。先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室方格后，再用高倍鏡測(cè)數(shù)。一般應(yīng)取上下及中央五個(gè)中格的總菌數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)若遇到位于線上的菌體，一般只計(jì)數(shù)格上方（下方）及右方（左方）線上的菌體。每個(gè)樣品重復(fù)3次。5.2.5

計(jì)算

取以上計(jì)數(shù)的平均值，按下列公式計(jì)算出每毫升菌液中的含菌量。菌體細(xì)胞數(shù)（cfu/mL）＝小格內(nèi)平均菌體細(xì)胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)5.2.6

清洗

計(jì)數(shù)板用畢后先用95%的形酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然后吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。若計(jì)數(shù)的樣品是病原微生物，則須先浸泡在5%石炭酸溶被中進(jìn)行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。圖7-2

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板6

結(jié)果6.1計(jì)算出目鏡測(cè)微尺在低、高倍鏡下的刻度值。6.2

記錄菌體大小的測(cè)定結(jié)果。6.3

計(jì)算樣品中酵母菌濃度。7

思考7.1

為什么隨著顯微鏡放大倍數(shù)的改變，目鏡測(cè)微計(jì)每格相對(duì)的長度也會(huì)改變？能找出這種變化的規(guī)律嗎？7.2

根據(jù)測(cè)量結(jié)果，為什么同種酵母菌的菌體大小不完全相同？7.3

能否用血球計(jì)數(shù)板在油鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)？為什么？7.4

根據(jù)自己體會(huì)，說明血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來自那些方面？如何減少誤差？

8

附錄目鏡測(cè)數(shù)尺有兩種：一是特制的目鏡鏡頭，鏡片上刻有50等分或100等分的刻度，使用時(shí)直接安裝在顯微鏡上，取代沒有刻度的目鏡鏡頭；另一種是一塊直徑大約17.5

mm的圓玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度(圖7-1A)，使用時(shí)將該玻璃片安裝在原來的目鏡鏡頭上即可。由于不同的顯微鏡放大倍數(shù)不同，既使同一顯微鏡在不同的目鏡、物鏡組合下其放大倍數(shù)也不同，故目鏡測(cè)微尺每格實(shí)際表示的長度隨顯微鏡放大倍數(shù)不同而異。也就是說，目鏡測(cè)微尺上的刻度只代表相對(duì)的長度。因此在使用前須用鏡臺(tái)測(cè)微尺校正，以確定在一定放大倍數(shù)下目鏡測(cè)微尺的每格長度。血球計(jì)數(shù)板是一塊特別的厚玻片，玻片中央分剖成兩個(gè)平面，上面各刻有9區(qū)，中央一區(qū)為計(jì)數(shù)室，供計(jì)數(shù)用(圖7-2A)，此區(qū)的長和寬各為1mm。中央平面兩側(cè)有小溝，小溝外有兩條突起的平臺(tái)，平臺(tái)比中央平面高0.1mm，因此計(jì)數(shù)室體積為0.1mm3，容積為10-4ml。通常計(jì)數(shù)室分為25個(gè)大格，每大格又分為16個(gè)小格，每小格容積為4×10-6ml，即lml菌液容積相當(dāng)于400萬個(gè)小格體積。因此只要將細(xì)胞懸液注人計(jì)算室，計(jì)算出一定數(shù)量小格的平均菌數(shù)即可算出每毫升的細(xì)胞數(shù)。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法基本原理

利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（

0．1mm2），所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。

血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。血球計(jì)數(shù)板構(gòu)造如圖Ⅷ-1。

計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格（圖Ⅷ-2）；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格（圖Ⅷ-1，C）。但無論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是相同的，即16×25=400小方格，如圖Ⅷ-2。

每一個(gè)大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0．1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0．1mm3。

在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。

下面以一個(gè)大方格有25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算：設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)大方格中的總菌數(shù)

因1ml=1cm3=1000mm3，

（即0.1mm3中的細(xì)菌總數(shù)）=A*B*25/5

故1ml菌液中的總細(xì)菌數(shù)=A*25*10*1000*B/5

=50000A·B（個(gè)）

二、器材

釀酒酵母菌懸液，血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細(xì)管。

三、操作步驟

1．稀釋

將釀酒酵母菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。

2．鏡檢計(jì)數(shù)室

在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3．加樣品

將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細(xì)口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多），讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自行進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。

4．顯微鏡計(jì)數(shù)

靜止5分鐘后，將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在計(jì)數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5—10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的值來計(jì)算樣品的含菌量。

5．清洗血球計(jì)數(shù)板

使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

上一篇：微生物數(shù)量的測(cè)定下一篇：實(shí)驗(yàn)三十一平板菌落計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)三十一平板菌落計(jì)數(shù)法錄入時(shí)間:2009-1-69:54:00來源：青島海博生物一、基本原理

平板菌落計(jì)數(shù)法是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個(gè)菌落是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成的現(xiàn)象進(jìn)行的，也就是說一個(gè)菌落即代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，先將待測(cè)樣品作一系列稀釋，再取一定量的稀釋菌液接種到培養(yǎng)皿中，使其均勻分布于平皿中的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)培養(yǎng)后，由單個(gè)細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可換算出樣品中的含菌數(shù)。

這種計(jì)數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)是能測(cè)出樣品中的活菌數(shù)。此法常用于某些成品檢定（如殺蟲菌劑），生物制品檢定以及食品、水源的污染程度的檢定等。但平板菌落計(jì)數(shù)法的手續(xù)較繁，而且測(cè)定值常受各種因素的影響。

二、器材

大腸桿菌懸液，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，

1ml無菌吸管，無菌平皿，盛有4．

5

ml無菌水的試管，試管架和記號(hào)筆等。

三、操作步驟

1．編號(hào)：

取無菌平皿

9套，分別用記號(hào)筆標(biāo)明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4．5ml無菌水的試管，排列于試管架上，依次標(biāo)明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2．稀釋

用1ml無菌吸管精確地吸取0．5ml大腸桿菌懸液放入10-1的試管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出時(shí)，管內(nèi)液體外溢。然后仍用此吸管將管內(nèi)懸液來回吸吹三次，吸時(shí)伸入管底，吹時(shí)離開水面，使其混合均勻。另取一支吸管自10-1試管吸0．5ml放入10-2試管中，吸吹三次，……其余依次類推。整個(gè)稀釋過程如圖Ⅷ-3。

3．取樣

用3支1ml無菌吸管分別精確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液0．2ml，對(duì)號(hào)放入編好號(hào)的無菌培養(yǎng)皿中。

4．倒平板

于上述盛有不同稀釋度菌液的培養(yǎng)皿中，倒入溶化后冷卻至45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基約10—15ml，置水平位置，迅速旋動(dòng)混勻，待凝固后，倒置于37℃溫室中培養(yǎng)。

5．計(jì)數(shù)

培養(yǎng)24小時(shí)后，取出培養(yǎng)皿，算出同一稀釋度三個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算：

每毫升中總活菌數(shù)=同一稀釋度三次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

一般選擇每個(gè)平板上長有30—300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的菌數(shù)最為合適。同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)的菌數(shù)不能相差很懸殊。由10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度計(jì)算出的每毫升菌液中總活菌數(shù)也不能相差懸殊，如相差較大，表示試驗(yàn)不精確。

平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般以三個(gè)稀釋度中的第二稀釋度倒平板所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。

平板菌蓓計(jì)數(shù)法的操作除上述的以外，還可用涂布平板的方法進(jìn)行。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化后倒平板，待凝固后編號(hào)，并于

37℃溫室中烘烤30分鐘左右，使其干燥，然后用無菌吸管吸取

0．2ml菌液對(duì)號(hào)接種于不同稀釋度編號(hào)的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基上，再用無菌玻璃刮棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上20—30分鐘，使菌液滲透入培養(yǎng)基內(nèi)，然后再倒置于37℃的溫室中培養(yǎng)。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

環(huán)境因素對(duì)微生物的影響錄入時(shí)間:2009-1-615:05:15來源：青島海博生物微生物的生命活動(dòng)要求一定的外界環(huán)境條件，外界環(huán)境條件適宜時(shí)，微生物進(jìn)行正常生長繁殖；不適宜時(shí)，則會(huì)使微生物生長受到抑制或發(fā)生變異，甚至死亡。

不同的環(huán)境因素對(duì)微生物的影響不同；同一因素因濃度或作用時(shí)間不同，對(duì)微生物的影響也不一樣；有的因素對(duì)某些微生物來講是必需的，而對(duì)另一些微生物又是有害的，如好氧微生物必須在有氧條件下才能生長繁殖，而厭氧微生物在有氧情況下將會(huì)受到抑制。在有害因素中，有的起抑制作用；有的表現(xiàn)為殺菌作用。

本實(shí)驗(yàn)通過化學(xué)、物理、生物和營養(yǎng)等環(huán)境因素對(duì)微生物影響的了解，以便為有益微生物創(chuàng)造適宜的生存條件，而對(duì)有害的微生物則設(shè)法控制或殺滅，使微生物能更好地為人類所利用。

生物基本知識(shí)->實(shí)驗(yàn)三十三化學(xué)因素對(duì)微生物的影響實(shí)驗(yàn)三十三化學(xué)因素對(duì)微生物的影響錄入時(shí)間:2009-1-615:06:24來源：青島海博生物一、基本原理

常用的化學(xué)消毒劑主要有重金屬及其鹽類，酚、醇、醛等有機(jī)化合物以及碘、表面活性劑等。它們的殺菌或抑菌作用主要是使菌體蛋白質(zhì)變性，或者與酶的—SH基結(jié)合而使酶失去活性所致。

本實(shí)驗(yàn)是觀察某些常用的化學(xué)藥品在一定濃度下對(duì)微生物的致死或抑菌作用，從而了解它們的殺菌或抑菌性能。

為了比較各種化學(xué)消毒劑的殺菌能力，常以石炭酸為標(biāo)準(zhǔn)，即將某一消毒劑作不同稀釋后，在一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)致死全部供試微生物的最高稀釋濃度，與達(dá)到同樣效果的石炭酸的最高稀釋度的比值，稱為這種消毒劑對(duì)該種微生物的石炭酸系數(shù)（酚系數(shù)）。石炭酸系數(shù)越大，說明該消毒劑殺菌能力越強(qiáng)。

二、器材

大腸桿菌，白色葡萄球菌（Staphylococcus

albus）；

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，2．5％碘酒，0．1％升汞（HgCl2），5％石炭酸，75％酒精，1％來蘇爾，0．25％新潔爾滅，

0．005％龍膽紫，0．05％龍膽紫；

培養(yǎng)皿，濾紙片，試管，吸管等。

三、操作步驟

1．各種化學(xué)藥品的殺菌作用

(1)用無菌吸管吸取培養(yǎng)18小時(shí)的白色葡萄球菌菌液0．2ml于無菌平皿內(nèi)。

(2)倒入已溶化并冷至45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基于上述平皿內(nèi)，充分搖勻，水平放置，待凝。

(3)將上述已凝固的平皿用記號(hào)筆在平皿底劃成八等份，每一等份內(nèi)標(biāo)明一種藥物的名稱。

(4)用無菌鑷子將小圓形濾紙片分別浸入各種藥品中，取出，并在試管內(nèi)壁上除去多余藥液后，以無菌操作將紙片對(duì)號(hào)放入培養(yǎng)皿的小區(qū)內(nèi)，如圖Ⅸ-1。

(5)將上述放好濾紙片的含菌平皿，倒置于37℃溫室中培養(yǎng)24小時(shí)后，取出測(cè)定抑菌圈大小，并說明其殺菌強(qiáng)弱。

2．石炭酸系數(shù)的測(cè)定

（1）將5％（1：20）的石炭酸液按表Ⅸ-1配成不同濃度，每管5ml。

（2）將待測(cè)藥物（來蘇爾）先配成1：20的原液，再按表Ⅸ-2配成不同濃度，每管

5ml。

（3）取肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基30管，1—15管標(biāo)明石炭酸的5種濃度，每種濃度3管，每3管分5、10、15分鐘處理，16—30管標(biāo)明來蘇爾的5種濃度，同樣每種濃度3管，每3管分5、10、15分鐘處理。

（4）在上述不同濃度的石炭酸和來蘇爾溶液中，各接入0．5ml大腸桿菌液，搖勻。注意每管自接種時(shí)起在5、10、15分鐘，用同一接種環(huán)從各管內(nèi)取一環(huán)接入上述已標(biāo)記的液體培養(yǎng)基試管中。

（5）置37℃溫室中培養(yǎng)

48小時(shí)，觀察并記錄生長情況。生長者溶液混濁，以“+”表示；不生長者溶液澄清，以“-”表示。

（6）計(jì)算系數(shù)值

找出在5分鐘生長，而在10分鐘和15分鐘均不生長的石炭酸及來蘇爾的最大稀釋度，計(jì)算二者的比值。例如石炭酸在10分鐘內(nèi)殺死大腸桿菌的最大稀釋度是1：70，來蘇爾是1：250，則來蘇爾的石炭酸系數(shù)為250/70=3．6。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)三十四氧對(duì)微生物的影響錄入時(shí)間:2009-1-615:07:49來源：青島海博生物一、基本原理

各種菌對(duì)氧的要求是不同的，根據(jù)它們對(duì)氧的要求或所能耐受的量可將細(xì)菌分為四個(gè)類型。專性好氧菌必須在有氧的情況下生存，例如枯草芽孢桿菌；專性厭氧菌則要求在完全無氧的條件下生長繁殖，分子氧對(duì)它們有害，例如破傷風(fēng)梭菌（Clostridiumtetani）、丙酮丁醇梭菌（C．a(chǎn)cetobutylcum）等；兼性厭氧菌無論在有氧或無氧的情況下均能生長，一般在有氧情況下生長快，例如酵母菌、腸道桿菌等屬于兼性厭氧菌；微好氧菌適宜于在氧濃度較低的環(huán)境中生長，例如鏈球菌屬中的個(gè)別種。

本實(shí)驗(yàn)采用深層瓊脂法來測(cè)定氧對(duì)細(xì)菌生長的影響，在葡萄糖牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基試管中接入某種細(xì)菌，通過適宜的培養(yǎng)條件，若細(xì)菌只生長在培養(yǎng)基表面，則為好氧菌；只生長在培養(yǎng)基底部，為厭氧菌；若表面及全部培養(yǎng)基中都生長，為兼性厭氧菌；生長在培養(yǎng)基中上部，為微好氧菌（圖Ⅸ-2）。這樣，根據(jù)細(xì)菌在試管培養(yǎng)基中生長的部位，就可以判斷各種細(xì)菌對(duì)氧的需要程度。

二、器材

大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，丙酮丁醇梭菌；

肉膏蛋白胨瓊脂試管培養(yǎng)基4支。

三、操作步驟

1．將肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基試管置于水浴鍋中加熱溶化。

2．待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，按無菌操作分別用接種環(huán)接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、丙酮丁醇梭菌各一環(huán)于試管培養(yǎng)基中，另一支試管中不接種作對(duì)照。搓動(dòng)試管，使細(xì)菌均勻混于培養(yǎng)基內(nèi)。

3．待凝固后，置于28℃溫室中培養(yǎng)48小時(shí)后開始觀察，連續(xù)觀察幾天，直至結(jié)果清晰時(shí)為止。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)三十五溫度對(duì)微生物的影響錄入時(shí)間:2009-1-615:08:31來源：青島海博生物一、基本原理

溫度是影響微生物生長與存活的重要因素之一。當(dāng)微生物處于最適生長溫度時(shí)，有刺激生長的作用；不適宜的溫度可以導(dǎo)致細(xì)菌的形態(tài)和代謝的改變或使微生物的蛋白質(zhì)凝固變性而導(dǎo)致死亡。不同的微生物對(duì)溫度的抵抗力不同，如大腸桿菌在60℃10分鐘內(nèi)致死，而枯草芽孢桿菌在100℃6—17分鐘內(nèi)才能致死，這是因?yàn)檠挎卟粌H含水量低，有厚而致密的壁，而且還含有特殊的物質(zhì)——吡啶二羧酸，所以芽孢桿菌的抗熱能力比大腸桿菌強(qiáng)。

二、器材

大腸桿菌，枯草芽孢桿菌；

肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基試管16支，吸管，恒溫水浴，溫度計(jì)等。

三、操作步驟

1．將培養(yǎng)48小時(shí)的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌斜面加入無菌生理鹽水各5ml，用接種環(huán)刮下菌體，制成菌懸液。

2．取肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基試管16支，從1至16編號(hào)并注明各管所接菌種的名稱和處理的溫度及時(shí)間。

3．在單號(hào)1、3、5、7、9、11、13、15管中各接入大腸桿菌懸液0．2ml，在雙號(hào)2、4、6、8、10、12、14、16管中各接入枯草芽孢桿菌懸液0．2ml。

4．將已接種的1—8管同時(shí)放入50℃水浴中，10分鐘后取出第1—4管。再過10分鐘（即處理20分鐘）后取出第5—8管；同法將接過菌種的第9—16管同時(shí)放入100℃水浴中，10分鐘后取出第9—12管。再過10分鐘（即20分鐘）后取出第13—16管。

5．上述各管取出后，立即用冷水沖涼，然后置37℃恒溫室內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察生長情況。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

知識(shí)->實(shí)驗(yàn)三十六滲透壓對(duì)微生物的影響實(shí)驗(yàn)三十六滲透壓對(duì)微生物的影響錄入時(shí)間:2009-1-615:09:12來源：青島海博生物一、基本原理

若將細(xì)菌置于低滲液或水中，菌體因吸收水分膨脹甚至破裂；如果將菌體置于高滲液中，則菌體內(nèi)的水分就會(huì)滲出，結(jié)果發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象。不同的細(xì)菌對(duì)滲透壓的抵抗力不同。但不論哪種細(xì)菌，對(duì)滲透壓的抵抗力是有一定限度的，超過一定限度則使菌體生長受到抑制，只有在等滲溶液中，微生物才能正常生長、繁殖，一般細(xì)菌在濃鹽液或濃糖液中不能生長、繁殖，所以糖或鹽可以保存食品。

二、器材

大腸桿菌，釀酒酵母；

含蔗糖量分別為2％、10％、20％、40％的合成培養(yǎng)基，含NaCl量分別為2％、10％、20％、40％的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，滅菌平皿等。

三、操作步驟

1．將不同含蔗糖量和不同含NaCl量的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化，冷至45℃左右，各倒平皿二個(gè)，待凝固。

2．在已凝固的平皿背面用記號(hào)筆劃成兩半，一半劃線接種大腸桿菌，另一半劃線接種釀酒酵母。

3．于28℃溫室中倒置培養(yǎng)4天后，觀察其生長情況。實(shí)驗(yàn)三十七pH對(duì)微生物的影響錄入時(shí)間:2009-1-615:09:58來源：青島海博生物一、基本原理

不同的微生物要求的最適pH值不同，一般來說，細(xì)菌和放線菌要求中性或微堿性的pH值，而酵母和霉菌則在偏酸的環(huán)境中生長。當(dāng)環(huán)境中的pH值超過或低于其適于生長的pH值范圍時(shí)，微生物的生長就會(huì)受到抑制。了解這個(gè)特性后，就可以配制不同pH值的培養(yǎng)基來培養(yǎng)不同的微生物，或選擇性地分離某種微生物。

二、器材

枯草芽孢桿菌，細(xì)黃鏈霉菌（Streptomyces

microflavus，5406放線菌），釀酒酵母，黑曲霉（Aspergillus

niger）。

盛有豆芽汁蔗糖培養(yǎng)液8ml的試管20支，

0．2mol/L

K2HPO4溶液，0．2mol/L

H3BO3，0．1mol/L檸檬酸溶液，0．2mol/L

NaOH溶液，1ml和2ml吸管若干支等。

三、操作步驟

1．按表Ⅸ-3配制不同pH值的培養(yǎng)基，每種pH值配4管。

2．將配好的培養(yǎng)基，進(jìn)行間歇滅菌（100℃蒸三次，每次20分鐘）。

3．取同一pH值的培養(yǎng)基4管，按無菌操作手續(xù)，分別接入枯草芽孢桿菌、細(xì)黃鏈霉菌（5406放線菌）、釀酒酵母、黑曲霉。

4、置28℃溫室培養(yǎng)3天后，取出觀察結(jié)果，并與未接種的培養(yǎng)基對(duì)照實(shí)驗(yàn)三十八生物因素對(duì)微生物的影響錄入時(shí)間:2009-1-615:10:44來源：青島海博生物一、基本原理

許多微生物在其生命活動(dòng)過程中能產(chǎn)生某種特殊的代謝產(chǎn)物，具有選擇性地抑制或殺死其他微生物的作用，例如抗生素。不同抗生素的抗菌譜是不同的，某些抗生素只對(duì)少數(shù)細(xì)菌有抗菌作用，例如青霉素一般只對(duì)革蘭氏陽性菌有抗菌作用，多粘菌素只對(duì)革蘭氏陰性菌有作用，這類抗生素稱為窄譜抗生素；而另一些抗生素則對(duì)多種細(xì)菌有作用，例如四環(huán)素、土霉素對(duì)許多革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有作用，這類抗生素稱為廣譜抗生素。

如果將產(chǎn)生某種抗生素的菌劃直線接種在豆芽汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，經(jīng)培養(yǎng)后，就會(huì)長出一條菌帶，并產(chǎn)生某種抗生素向菌帶周圍擴(kuò)散。再與這條菌帶相垂直劃直線接種某些不同的試驗(yàn)菌，就會(huì)產(chǎn)生不同長度的抑菌帶，如圖Ⅸ-3。根據(jù)抑菌帶的長短，即可判斷該抗生素對(duì)不同微生物的影響。本實(shí)驗(yàn)說明產(chǎn)黃青霉產(chǎn)生的青霉素對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果。

二、器材

產(chǎn)黃青霉（Peenicillium

chrysogenum）、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌；

豆芽汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，無菌平皿，接種環(huán)等。

三、操作步驟

1．將豆芽汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溶化后，冷至45℃左右倒平板，凝固待用。

2．用接種環(huán)挑取產(chǎn)黃青霉的孢子在平板上按圖Ⅸ-3，1所示劃一直線。

3．接種后，倒置于28℃溫室中培養(yǎng)2—3天。

4．待上述平板形成菌苔后，再用接種環(huán)從產(chǎn)黃青霉菌的菌帶邊緣但不要接觸菌苔分別垂直向外劃直線（圖Ⅸ-3，2）接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。

5．倒置于37℃溫室培養(yǎng)24小時(shí)。

6．觀察結(jié)果。微生物的生理生化反應(yīng)錄入時(shí)間:2009-1-615:11:11來源：青島海博生物

各種細(xì)菌在代謝類型上表現(xiàn)了很大的差異。不同的細(xì)菌分解大分子碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的能力不同，所能發(fā)酵的類型和最終產(chǎn)物也不一樣。不同細(xì)菌對(duì)營養(yǎng)的要求不同也說明了它們有不同的合成能力。所有這些都反映了它們是有不同的酶系統(tǒng)。

細(xì)菌的這種生化反應(yīng)的多樣性在自然界產(chǎn)生了兩種結(jié)果：第一、使自然界所有的有機(jī)分子都有可能得到分解；第二、使不同細(xì)菌之間有了互相作用和互相依賴的基礎(chǔ)，例如，一種微生物能利用另一種微生物所分解的產(chǎn)物。

另一方面，細(xì)菌的生化反應(yīng)的多樣性也被人們作為細(xì)菌的鑒定和分類方法來利用。

本部分是通過細(xì)菌對(duì)大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、鑒定腸道菌的其他不同生化反應(yīng)和微生物的代謝產(chǎn)物抗生素的測(cè)定等幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，來證明不同的細(xì)菌其生化功能的多樣性和微生物之間的互相作用十大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)四十大分子物質(zhì)的水解試驗(yàn)錄入時(shí)間:2009-1-615:12:47來源：青島海博生物一、基本原理

細(xì)菌對(duì)大分子的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶將大分子物質(zhì)分解。胞外酶能分泌擴(kuò)散到細(xì)胞外，將物質(zhì)分解成小單位如糖、氨基酸、甘油與脂肪酸。這些小單位的物質(zhì)能被細(xì)菌吸收和利用。水解過程可通過底物的變化來證明，如細(xì)菌水解淀粉的區(qū)域，用碘測(cè)定不再產(chǎn)生藍(lán)色；水解明膠可觀察到明膠被液化；脂肪水解后產(chǎn)生脂肪酸改變培養(yǎng)基的pH，其中的中性紅指示劑使培養(yǎng)基從淡紅色變?yōu)樯罴t色。

二、器材

金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，大腸桿菌，綠膿桿菌（Bacte-rium

Pyocyaneum）斜面各一支；

油脂培養(yǎng)基，淀粉培養(yǎng)基，明膠培養(yǎng)基，無菌平皿，接種環(huán)和接種針，革蘭氏染色用盧戈氏碘液（Lugols

iodine

solution）等。

1．油脂水解試驗(yàn)

(1)將溶化的油脂培養(yǎng)基冷至45℃左右時(shí)，充分振蕩，使油脂均勻分布，用無菌操作倒入平皿中，待凝。

(2)將制成的平板用記號(hào)筆劃成兩半，一半接種金黃色葡萄球菌作為對(duì)照，另一半接種枯草芽孢桿菌作為試驗(yàn)菌，均用無菌操作畫“+”接種，如圖Ⅹ-1。

(3)將接種的平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)24小時(shí)。

(4)取出平板，觀察平板底層長菌的地方，如出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，說明脂肪被水解，為陽性反應(yīng)。

2．淀粉水解試驗(yàn)

(1)將淀粉培養(yǎng)基溶化后，冷至45℃左右，以無菌操作制成平板。

(2)用記號(hào)筆將平板劃成兩半，一半接種大腸桿菌作為試驗(yàn)菌，另一半接種枯草芽孢桿菌作為對(duì)照菌，均用無菌操作劃線接種，如圖Ⅹ-2。

(3)將上述已接種的平板倒置于37℃溫室中培養(yǎng)24小時(shí)。

(4)將已培養(yǎng)24小時(shí)的平皿取出，打開皿蓋，滴加少量盧戈氏碘液于平板上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。如菌苔周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉已被水解。透明圈的大小、說明該菌水解淀粉能力的強(qiáng)弱。

3．明膠液化試驗(yàn)

(1)取三管明膠培養(yǎng)基，用記號(hào)筆標(biāo)明各管接種的菌名。分別以無菌操作用接種針穿刺接種大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌。

(2)接種后，置20℃溫室中培養(yǎng)2—5天。

(3)觀察明膠培養(yǎng)基液化情況（圖Ⅹ-3）。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)室常用貯存液的配制參數(shù)（上）錄入時(shí)間:2011-4-1910:01:16來源：互聯(lián)網(wǎng)1.30%丙烯酰胺溶液

【配制方法】將29g丙烯酰胺和1gN，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為60ml的水中。加熱至37℃溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。用Nalgene濾器(0.45μm孔徑)過濾除菌，查證該溶液的pH值應(yīng)不大于7.0，置棕色瓶中保存于室溫。

【注意】丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具。可認(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能會(huì)含有少量未聚合材料。一些價(jià)格較低的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺通常含有一些金屬離子，在丙烯酰胺貯存液中加入大約0.2體積的單床混合樹脂(MB-1Mallinckrodt)，攪拌過夜，然后用Whatman1號(hào)濾紙過濾以純化之。在貯存期間，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酰和雙丙烯酸。

2.40%丙烯酰胺

【配制方法】把380g丙烯酰胺(DNA測(cè)序級(jí))和20gN，N’-亞甲雙丙烯酰胺溶于總體積為600ml的蒸餾水中。繼續(xù)按上述配制30%丙烯酰胺溶液的方法處理，但加熱溶解后應(yīng)以蒸餾水補(bǔ)足至終體積為1L。

【注意】見上述配制30%丙烯酰胺的說明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列測(cè)定。

3.放線菌素D溶液

【配制方法】把20mg放線菌素D溶解于4ml100%乙醇中，1：10稀釋貯存液，用100%乙醇作空白對(duì)照讀取OD440值。放線菌素D(分子量為1255)純品在水溶液中的摩爾消化系數(shù)為21，900，故而1mg/ml的放線菌素D溶液在440nm處的吸光值為0.182，放線菌素D的貯存液應(yīng)放在包有箔片的試管中，保存于-20℃。

【注意】放線菌素D是致畸劑和致癌劑，配制該溶液時(shí)必須戴手套并在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，而不能在開放在實(shí)驗(yàn)桌面上進(jìn)行，謹(jǐn)防吸入藥粉或讓其接觸到眼睛或皮膚。

藥廠提供的作治療用途的放線菌素D制品常含有糖或鹽等添加劑。只要通過測(cè)量貯存液在440nm波長處的光吸收確定放線菌素D的濃度，這類制品便可用于抑制自身引導(dǎo)作用。

4.0.1mol/L腺苷三磷酸(ATP)溶液

【配制方法】在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/LNaOH調(diào)至pH值至7.0，用蒸餾水定容1ml，分裝成小