內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座專家講座

內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題（一）匯報(bào)人：張宇飛綿羊肺腺瘤病毒研究小組內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第1頁(yè)綿羊肺腺瘤病綿羊肺腺瘤病病原是綿羊肺腺瘤病毒（jaagsiektesheepretrovirus，JSRV），其主要臨床癥狀為咳嗽、呼吸困難、虛弱、漸進(jìn)性消瘦、大量漿液性鼻漏；主要病變?yōu)榉闻茛蛐蜕掀ぜ?xì)胞（typeⅡ

pneumocytes）和無(wú)纖毛細(xì)支氣管上皮細(xì)胞（claracells）腺泡樣腫瘤性增生。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第2頁(yè)綿羊肺腺瘤病毒綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA為線性單股正鏈RNA，全長(zhǎng)7642bp。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第3頁(yè)該病毒基因組RNA編碼區(qū)內(nèi)有相互重合gag、pro、pol和env基因經(jīng)典結(jié)構(gòu)。gag基因編碼病毒衣殼蛋白（capsidprotein，CA）、核衣殼蛋白（nucleocapsidprotein，NC）和基質(zhì)蛋白（matrixprotein，MA），而gag基因編碼區(qū)第513～1400bp段主要編碼衣殼蛋白，衣殼蛋白組成病毒粒子雙層殼內(nèi)殼，與病毒抗原性相關(guān)。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第4頁(yè)JSRVpro基因所編碼蛋白以聚合多肽蛋白前體Gag-pro形式表示。pro基因5’端和3’端分別編碼dUTP酶和羧基蛋白酶PR，dUTP酶能夠預(yù)防反轉(zhuǎn)錄酶誤裝配三磷酸脫氧尿苷，而PR負(fù)責(zé)裂解前體多肽蛋白。二者在病毒粒子反轉(zhuǎn)錄、成熟與包裝等病毒生活周期中起關(guān)鍵作用。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第5頁(yè)pol基因主要編碼病毒反轉(zhuǎn)錄酶（reverse

transcriptase，RT）和整合酶（integrase，IN），RT負(fù)責(zé)把病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為病毒cDNA，IN負(fù)責(zé)將前病毒DNA基因組整合至宿主細(xì)胞染色體DNA中。env基因主要編碼病毒囊膜蛋白，蛋白質(zhì)部分由二條肽鏈組成，較小一條鏈貫通病毒囊膜，稱為跨膜蛋白（transmembraneprotein，TM），較大鏈經(jīng)過(guò)二硫鍵和氫鍵與TM相連，稱為表面蛋白（surfaceprotein，SU）。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第6頁(yè)EndogenousRetrovirusesinTrophoblastDifferentiationand

PlacentalDevelopment在滋養(yǎng)層分化和胎盤發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒SarahG.Black1,FredrickArnaud2,3,MassimoPalmarini2,ThomasE.Spencer1

得克薩斯大學(xué)

一、序言二、方法三、結(jié)果四、結(jié)論內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第7頁(yè)一、序言(Introduction)內(nèi)源性病毒是指病毒在首次感染機(jī)體或細(xì)胞后，其基因組被整合到宿主細(xì)胞DNA中，并成為宿主細(xì)胞基因組一部分，即以前病毒形式存在，前病毒DNA可經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂傳遞給子代細(xì)胞。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第8頁(yè)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ERV）ERVs存在于全部脊椎動(dòng)物基因組中并遵照孟德?tīng)柗▌t遺傳給下一代。ERVs在宿主基因組中大量存在，比如人基因組中大約有8~10%ERVs。一個(gè)完整ERVs前病毒和外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒有一樣基因結(jié)構(gòu)。假如ERVs表示產(chǎn)物對(duì)宿主有害話，宿主將會(huì)毀滅它們。ERVs存在于宿主基因組中，是長(zhǎng)久進(jìn)化結(jié)果。通常因?yàn)橥蛔?、缺失、重排和甲基化積累給予了ERVs不健全復(fù)制機(jī)制。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第9頁(yè)當(dāng)代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒當(dāng)代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒是指在物種形成后才整合到宿主基因組中，而且非?？拷袀魅拘酝庠葱阅孓D(zhuǎn)錄病毒。這些當(dāng)代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒包含綿羊肺腺瘤病毒、小鼠乳腺癌病毒、貓白血病病毒、雞白血病病毒。許多當(dāng)代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠產(chǎn)生感染性病毒粒子，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈︹g化突變。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第10頁(yè)ERVs在過(guò)去被認(rèn)為是垃圾DNA，但最近研究表明ERVs對(duì)其宿主有主要生物學(xué)作用。因?yàn)橥暾_(kāi)放閱讀框和轉(zhuǎn)錄活性支持了之一觀點(diǎn)。ERVs大量存在于各種動(dòng)物生殖道和胎盤內(nèi)。完整ERVsenv基因在胎盤巨核細(xì)胞內(nèi)表示且維持了數(shù)千年。此基因表示產(chǎn)物可引發(fā)體外培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生融合。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第11頁(yè)二、ERVsinthehuman,mouse,andrabbitplacenta在人類、小鼠、兔子和綿羊胎盤內(nèi)反轉(zhuǎn)錄病毒人類小鼠兔子綿羊內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第12頁(yè)2.1人類HERV-W、HERV-FRD和ERV-3是3個(gè)人類內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒。他們完整env基因在人類胎盤中表示。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第13頁(yè)2.1.1HERV-WHERV-W不以完整前病毒存在與人類基因組當(dāng)中，然而他env基因編碼蛋白叫做syncytin1,在核胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞中優(yōu)先表示。syncytin1是一個(gè)糖蛋白且含有反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜蛋白特點(diǎn)，比如：前導(dǎo)肽、弗林蛋白酶切割位點(diǎn)、融合肽樣序列、公認(rèn)免疫抑制區(qū)和跨膜區(qū)。這些大量體外信息都暗示了，syncytin1與人類胎盤當(dāng)中單核滋養(yǎng)層細(xì)胞融合成雙核滋養(yǎng)呈細(xì)胞相關(guān)。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第14頁(yè)有些人經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染HERV-W-env誘導(dǎo)了許多細(xì)胞系發(fā)生融合，當(dāng)用抗HERV-W-env抗體處理細(xì)胞后細(xì)胞融合數(shù)量降低了。經(jīng)過(guò)高表示syncytin1和forskolin共同誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞融合，當(dāng)抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞中syncytin1表示時(shí)，培養(yǎng)雙核滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量降低。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第15頁(yè)2.1.2HERV-FRDHERV-FRD囊膜蛋白被稱為syncytin2，它結(jié)構(gòu)與syncytin1類似。然而syncytin2要比syncytin1整合到人類基因組上要早得多。當(dāng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染syncytin2時(shí)也能引發(fā)細(xì)胞融合。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第16頁(yè)2.1.3ERV-3ERV-3囊膜蛋白也出現(xiàn)在滋養(yǎng)層當(dāng)中，但在他開(kāi)放閱讀框中提前出現(xiàn)了終止密碼子，造成他失去了跨膜區(qū)等多個(gè)功效區(qū)。ERV-3囊膜蛋白不能引發(fā)細(xì)胞融合即使在BeWo細(xì)胞當(dāng)中高表示ERV-3囊膜基因且同時(shí)用forskolin處理，也不能引發(fā)細(xì)胞融合。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第17頁(yè)ERV-3在滋養(yǎng)層細(xì)胞中穩(wěn)定表示，它可誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞分化、人絨毛膜促性腺激素分泌量增加、形態(tài)改變。研究認(rèn)為ERV-3-env在許多正常組織中表示，尤其在產(chǎn)生激素器官中包含腎上腺、皮脂腺和睪丸當(dāng)中表示。他可能在激素分泌過(guò)程中飾演了主要角色。但150個(gè)健康白種人當(dāng)中有1.5個(gè)人ERV-3-env基因提前終止（理論上沒(méi)有功效）。所以人們爭(zhēng)論ERV-3是否含有生物學(xué)功效。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第18頁(yè)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第19頁(yè)2.2小鼠在小鼠胎盤迷路滋養(yǎng)層細(xì)胞中表示兩種內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜蛋白syncytinA和syncytinB。syncytinA和syncytinB是同源基因且高度保守。syncytinA在小鼠滋養(yǎng)層發(fā)育飾演了主要角色，因?yàn)槿笔yncytinA小鼠胎盤里單核細(xì)胞不能融合形成多核細(xì)胞而發(fā)生流產(chǎn)。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第20頁(yè)２．３兔子最近，Heidmannetetal.發(fā)覺(jué)兔子反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜基因且命名為syncytin－OryⅠ，他與人類syncytin特征相同。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)研究發(fā)覺(jué)在兔子胎盤中特定表示syncytin－OryⅠ在兔子基因組當(dāng)中含有完整開(kāi)放閱讀框。syncytin－OryⅠｍＲＮＡ被發(fā)覺(jué)在兔子胎盤連接處即胎兒組織侵入母體子宮兌膜后形成迷路滋養(yǎng)層中高表示。這與syncytin在滋養(yǎng)層形成過(guò)程中有主要作用觀點(diǎn)一致！內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第21頁(yè)２．４綿羊綿羊基因組當(dāng)中最少有２７個(gè)拷貝ERVs，因?yàn)樗鼈兣c外源性綿羊肺腺瘤（JSRV）非常相同，故命名為enJSRVs。JSRV是綿羊肺腺瘤病原，含有傳染性。JSRV不一樣于其它致癌反轉(zhuǎn)錄病毒是因?yàn)樗掳┗蚴悄夷さ鞍?。盡管JSRV囊膜蛋白引發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中與促細(xì)胞分裂蛋白激酶（Ras-MEK-MAPK）、RacⅠ和磷酸次黃苷酸３激酶（PI3K-AKT-MTOR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，但詳細(xì)機(jī)制還沒(méi)有完全搞清楚。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第22頁(yè)２７個(gè)enJSRV前病毒中有大部分因?yàn)槿笔蛔冊(cè)斐刹煌暾Ｈ欢校祩€(gè)enJSRV前病毒含有完整開(kāi)放閱讀框。JSRV和enJSRV相同性非常高，所以enJSRV侵入綿羊基因組當(dāng)中時(shí)間不長(zhǎng)，甚至現(xiàn)在還一直在侵入。蒙古綿羊在不一樣妊娠時(shí)期（30d、50d、70d、90d、110d和130d）子宮和胚胎組織中都有enJSRVmRNA表示。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出：胎盤組織中enJSRV基因表示于90d時(shí)到達(dá)高峰，然后開(kāi)始下降，直至妊娠130d時(shí)表示量到達(dá)最低；子宮內(nèi)膜組織中enJSRVmRNA表示于30d和50d相對(duì)較高；絨毛膜組織中enJSRVmRNA表示于妊娠50d時(shí)表示量最低，70d和110d相對(duì)較高。（徐萌杰博士論文）內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第23頁(yè)３、綿羊胎盤和孕體發(fā)育過(guò)程受精卵發(fā)育與運(yùn)行

因?yàn)檩斅压芄鼙诩∪馊鋭?dòng)及輸卵管粘膜纖毛擺動(dòng)，受精卵漸漸向子宮腔方向移動(dòng)，在受精后3～4天抵達(dá)宮腔，在運(yùn)行過(guò)程中進(jìn)行有絲分裂，受精卵抵達(dá)輸卵管子宮端時(shí)已成為一個(gè)實(shí)心細(xì)胞團(tuán)，形如桑椹，故稱桑椹胚。桑椹胚一面前行，一面繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞分裂，外層細(xì)胞分裂較快，形成囊壁，稱為滋養(yǎng)層，是受精卵接觸母體部分，它將形成胎盤及其它胚外結(jié)構(gòu)。內(nèi)層細(xì)胞分裂較慢，形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，是胚胎發(fā)育始基。此時(shí)受精卵稱為囊胚或胚泡。約在受精后7～8天，滋養(yǎng)層細(xì)胞與子宮內(nèi)膜接觸時(shí)分化出合體細(xì)胞。子宮內(nèi)膜被合體細(xì)胞蛋白分解酶破壞，囊胚即侵入子宮內(nèi)膜致密層，子宮內(nèi)膜表面快速修復(fù)，囊胚即埋于子宮內(nèi)膜中。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第24頁(yè)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第25頁(yè)約在受精后9～10天，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)很快增殖與分化，分裂成兩層，即外胚層與內(nèi)胚層。兩層細(xì)胞分裂都很快，并各形成一空腔，即羊膜腔與卵黃囊，二者之間組織稱為胚盤。第12天使形成卵圓形孕體，且之后開(kāi)始慢慢變長(zhǎng)。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第26頁(yè)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第27頁(yè)在胚胎發(fā)育成桑椹胚后，桑椹胚深入發(fā)育，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)分化。聚集在胚胎一端，個(gè)體較大細(xì)胞，稱為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass，ICM），未來(lái)發(fā)育成胎兒各種組織，而沿透明帶內(nèi)壁擴(kuò)展和排列，個(gè)體較小細(xì)胞，稱為滋養(yǎng)層細(xì)胞，它們未來(lái)發(fā)育成胎膜和胎盤。絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞在妊娠中期可分成兩種類型：合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞有絲分裂活躍，形成新滋養(yǎng)細(xì)胞，新滋養(yǎng)細(xì)胞膜消失，融合形成合體滋養(yǎng)細(xì)胞。合體滋養(yǎng)細(xì)胞是人體正常細(xì)胞中唯一含有侵襲能力細(xì)胞，類似于腫瘤細(xì)胞，含有一定侵襲能力，這種能力對(duì)胚泡著床及胎盤形成都有十分主要意義。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第28頁(yè)BNC形成綿羊單核滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞（mononuclear

trophoblasticcell，MTC）從妊娠第14天開(kāi)始分化、移行，之后經(jīng)過(guò)核內(nèi)復(fù)制或融合作用形成滋養(yǎng)外胚層巨型雙核細(xì)胞（trophoblasticgiant

binucleatedcell，BNC），BNC繼而移行并與子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞（luminal

epithelium，LE）融合為三核細(xì)胞，三核細(xì)胞與BNC融合，形成多核合胞體，多核合胞體融聚成多核合胞體小半鞘翅（multinucleatedsyncytiaplaques）（20～25個(gè)核），最終形成胎盤子葉。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第29頁(yè)在母羊生殖道不一樣組織上皮中大量表示enJSRV。尤其在子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮當(dāng)中可檢測(cè)到enJSRVmRNA和蛋白。有趣是，HYAL2(是JSRV和enJSRV受體)被專一檢測(cè)到在胎盤BNC和小半鞘翅中表示。有研究者經(jīng)過(guò)在妊娠8天母羊子宮內(nèi)注射嗎啉代，抑制enJSRV囊膜蛋白翻譯。結(jié)果單核滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量降低且BNC分化也減弱了。這讓許多科學(xué)家提出了綿羊多核合胞體形成假說(shuō)。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第30頁(yè)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第31頁(yè)當(dāng)前，綿羊胎盤和孕體發(fā)育過(guò)程中enJSRV和HYAL2所起作用和詳細(xì)機(jī)制還沒(méi)有完全搞清楚。因?yàn)閑nJSRVEnv與exJSRVEnv高度相同。所以人們猜測(cè)enJSRVEnv與exJSRVEn