酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座

試驗?zāi)繕?biāo)1、學(xué)習(xí)稀堿法提取酵母RNA粗制品原理和方法。2、了解核酸組分，并掌握判定核酸組分方法。3、學(xué)習(xí)離心機使用方法。酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第1頁離心機原理和應(yīng)用離心就是利用離心機轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生強大離心力，加緊液體中顆粒沉降速度，把樣品中不一樣沉降系數(shù)和浮力密度物質(zhì)分離開。rpm—revolutionsperminute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)RCF---Relativecentrifugalforce相對離心力，是指在離心場中，作用于顆粒離心力相當(dāng)于地球重力加速度g倍數(shù)

4000rpm4000g

RCF=1.119×10－5×(rpm)2r

其中r表示離心機轉(zhuǎn)軸中心與離心管中心距離單位為cm。因為離心管位置由轉(zhuǎn)子（rotor）決定，所以r必須由查閱相關(guān)轉(zhuǎn)子參數(shù)而得。

使用注意：配平！離心參數(shù)調(diào)整：轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)速和離心時間酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第2頁酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第3頁核糖核酸（Ribonucleicacid，RNA）

由核糖核苷酸經(jīng)過磷酸二酯鍵連接而成一類核酸,因含核糖而得名。RNA種類：mRNA，tRNA和rRNA，另外snRNA（年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎）。核苷-5′-磷酸酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第4頁酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體2.67%-10.0%，而DNA含量僅為0.03%-0.516%。工業(yè)上制備RNA多項選擇取成本低、適于大規(guī)模操作稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取核酸均為變性RNA，主要用作制備單核苷酸原料，其工藝比較簡單。應(yīng)用領(lǐng)域：調(diào)味品和食品添加劑酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第5頁試驗原理稀堿法是用氫氧化鈉使酵母細(xì)胞壁變性、裂解，離心除去蛋白質(zhì)和菌體后，上清液用乙醇使RNA沉淀，由此即得到RNA粗制品。RNA含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分，加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中能夠判定上述組分。酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第6頁RNA組份判定（1）嘌呤堿與硝酸銀作用產(chǎn)生白色嘌呤銀化合物沉淀。（2）苔衣酚顯色法：核糖核酸與濃鹽酸共熱時，即發(fā)生降解，形成核糖繼而轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，后者與苔衣酚（3，5-二羥基甲苯）反應(yīng)呈鮮綠色，該反應(yīng)需用三氯化鐵或氯化銅作催化劑。（3）磷酸與定磷試劑中鉬酸銨作用生成磷鉬酸，并被Vc還原成藍(lán)色復(fù)合物鉬藍(lán)。酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第7頁試驗儀器1.研缽2.水浴鍋3.量筒4.滴管5.試管及試管架6.燒杯7.離心機8.錐形瓶酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第8頁試劑和材料1.0.04mol/L氫氧化鈉溶液6.定磷試劑2.三氯化鐵濃鹽酸溶液7.酸性乙醇溶液3.0.1mol/L硝酸銀溶液8.苔黑酚乙醇溶液4.1.5mol/L硫酸溶液9.酵母粉5.濃氨水酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第9頁操作步驟（一）酵母RNA粗制品提取1、將酵母片在研缽中研磨均勻，稱取4g酵母粉懸于30mL0.04mol/LNaOH溶液中(錐形瓶)。在沸水浴上加熱30分鐘后，冷卻。2、4000r/min離心5分鐘后，分成上清和沉淀兩層，沉淀主要成份就是變性蛋白質(zhì)，RNA包含在上清中。酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第10頁3、將上清液緩緩傾入30mL酸性乙醇溶液中。注意要一邊攪拌一邊緩緩傾入。待核糖核酸沉淀完全后，離心（4000rpm）5分鐘。棄去上清液。注：離心前，離心管（包含轉(zhuǎn)頭）一定要對稱兩管在天平上配平，第一次用NaOH溶液，第二次用酸性乙醇。兩次使用膠頭滴管要分開放置酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第11頁（二）組分判定1、水解：提取核酸溶解于10mL1.5mol/L硫酸溶液中，在沸水浴中加熱10min制成水解液，進行組分判定。酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第12頁2.嘌呤堿：取一只試管，加入1ml水解液，加入過量濃氨水（用膠頭吸管吸2管約2ml），再加入1ml0.1mol/L硝酸銀，觀察有沒有白色嘌呤堿銀化合物沉淀生成。嘌呤銀絡(luò)合物在堿性條件下易形成白色絮狀沉淀。酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第13頁3.核糖：取一只試管，加入水解液1ml，三氯化鐵濃鹽酸溶液2ml，加入苔黑酚乙醇溶液0.2ml，放入沸水浴中5min。注意溶液是否變墨綠色。核糖在濃鹽酸中，與苔黑酚（3，5-二羥甲苯）及三氯化鐵鹽酸試劑共熱，產(chǎn)生綠色絡(luò)合物。酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第14頁4.磷酸：取一只試管，加入水解液1ml和定磷試劑1ml，在沸水浴中加熱。觀察溶液是否變成藍(lán)色。磷酸與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生磷鉬酸，磷鉬酸在還原劑抗壞血酸(Vc)作用下形成藍(lán)色復(fù)合物鉬藍(lán)。酵母核糖核酸的分離及組分鑒定專家講座第15頁1.稀堿法提取RNA為變性RNA，可用于RNA組分判定及單核苷酸制備，不能作為RNA生物活性試驗材料。2.苔黑酚反應(yīng)特異性較差，凡戊糖都有此反應(yīng)。所以地衣酚試驗不能作為RNA與DNA判別依據(jù)。。3.試劑瓶中溶液用膠頭滴管取用，吸1管約為1毫升，0.2ml用膠頭滴管取4滴即可（每滴約為0.05毫升），4.離心：兩組配平5.請將試劑瓶放在原處取用，以免其它同學(xué)不能找