HPLC-MSMS法測定化妝品中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1

摘要建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測定化妝品中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的方法?；瘖y品經(jīng)70%甲醇提取并經(jīng)免疫親和柱凈化，采用C18柱（2.1mm×100mm,1.7μm），流動相體系為2.0mmol/L乙酸銨甲醇溶液（含0.1%甲酸）和2.0mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），流速為0.3mL/min進(jìn)行梯度洗脫，掃描方式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1線性關(guān)系均良好，相關(guān)系數(shù)不低于0.998。檢出限范圍為0.028～0.078ng/g。精密度及穩(wěn)定性均良好，回收率85.0%～96.2%。該方法準(zhǔn)確、高效，為化妝品中黃曲霉毒素的測定提供了技術(shù)支持。引言黃曲霉毒素（AFT）是致癌性極強(qiáng)的一類霉菌毒素，它們種類繁多、結(jié)構(gòu)不一，目前最常見的有黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1，它們有極強(qiáng)的致癌和致突變特性，能夠造成人體的肝、膽、腎、脾等內(nèi)臟組織損傷。黃曲霉毒素主要存在于谷物及產(chǎn)品、堅果和香料類產(chǎn)品中，特別容易在大豆、花生等農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)生，而這些農(nóng)產(chǎn)品是重要的植物油脂來源。作為一類常用的化妝品基礎(chǔ)原料，植物油脂的作用非常大。植物油脂可以在皮膚表面形成一層憎水性薄膜，尤其是當(dāng)氣溫下降時，憎水性薄膜可以減少皮膚表面水分蒸發(fā)，同時軟化角質(zhì)層，使之恢復(fù)彈性，因此廣泛應(yīng)用于各類化妝品中。同時，植物油脂也是一類良好的活性物質(zhì)載體，在承載活性成分時，可使一些活性成分刺激性降低、功效增強(qiáng)。用于化妝品的原料植物油脂主要有棕櫚油、橄欖油、霍霍巴油等，但近年來因市場降低成本的要求，其他常見植物油脂也開始應(yīng)用于化妝品中。霉菌毒素污染是植物油脂存在的重要安全隱患，已成為威脅植物油脂安全的主要問題之一。若油基類化妝品所用原料油脂被黃曲霉毒素污染，則可能造成此類化妝品中含有黃曲霉毒素。據(jù)報道，從8種不同類型的化妝品中檢測出多種黃曲霉毒素，它們能經(jīng)皮膚吸收，嚴(yán)重危害人們的身心健康。然而，目前對于化妝品中黃曲霉毒素的檢測仍為空白，因此，亟需建立選擇性好、靈敏度高的檢測方法，用于化妝品中黃曲霉毒素的檢測。黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1結(jié)構(gòu)類似，母核均為二氫呋喃香豆素，各分子結(jié)構(gòu)如下圖所示，區(qū)別僅在于A環(huán)是否為不飽和環(huán)、E環(huán)為五元環(huán)或六元環(huán)。目前用于檢測黃曲霉毒素的方法主要有ELISA法（酶聯(lián)免疫法）、TLC法（薄層色譜法）、HPLC法以及LC-MS/MS法等。由于化妝品基質(zhì)復(fù)雜，傳統(tǒng)凈化方式很難做到干擾成分的去除。免疫親和柱法（IAC）是一種新興的免疫色譜技術(shù)，它選用特異性結(jié)合的抗原抗體，根據(jù)其可逆結(jié)合特性提取目標(biāo)化合物，有很好的凈化效果。本文將免疫親和凈化柱法、高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）結(jié)合，通過前處理及色譜-質(zhì)譜條件的不斷優(yōu)化，建立了能夠高選擇性測定化妝品中的黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的方法，為化妝品的風(fēng)險監(jiān)測和后期監(jiān)督抽驗提供了科學(xué)的檢驗方法依據(jù)。

正文部分1

實驗部分1.1

主要儀器與材料1.2

溶液制備1.2.1

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制精密量取黃曲霉毒素總量（G2、G1、B2、B1）混合對照品溶液適量，用甲醇稀釋成一系列濃度的混合對照品工作液，具體濃度見表1。1.2.2

樣品溶液制備準(zhǔn)確稱取約2.5g混合均勻的化妝品樣品，置于50mL離心管中，加入20mL70%甲醇，渦旋3min混勻，室溫下超聲提取15～20min，6000r/min離心10min，移取4mL上清液，加入20mL含1%吐溫-20的PBS溶液并混勻，然后將其全部轉(zhuǎn)移到免疫親和柱上，待樣液流盡后，分別用10mL水洗滌免疫親和柱兩次。1.3

色譜和質(zhì)譜條件液相色譜條件：色譜柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18（2.1mm×100mm,1.7μm）；流動相：A：2.0mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），B：2.0mmol/L乙酸銨甲醇（含0.1%甲酸）；柱溫：30℃；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：2μL。梯度洗脫程序見表2。2

結(jié)果與討論2.1

線性范圍、檢出限與定量限將4種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣，以4種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。4種黃曲霉毒素的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表4。2.2

日內(nèi)及日間精密度將黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，以6次測定峰面積考察方法的日內(nèi)精密度，RSD范圍為2.11%～2.63%；在相同實驗條件下連續(xù)6天進(jìn)樣，考察方法的日間精密度，RSD范圍為1.78%～2.13%，具體結(jié)果見表5，該結(jié)果表明所建方法精密度良好。2.3

穩(wěn)定性將黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按上述實驗方法分別在0、2、4、8、16、24、48h進(jìn)行測定，以測定濃度值計算的RSD，考察4種黃曲霉毒素的穩(wěn)定性。RSD分別為0.96%、2.34%、2.16%、1.41%，說明該方法測定化妝品中4種黃曲霉毒素在48h內(nèi)穩(wěn)定。2.4

回收率向空白化妝品樣品（某品牌卸妝油）中添加高、中、低3種不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平各平行制備3份，按所建立的方法進(jìn)行測定，進(jìn)行回收率試驗，回收率結(jié)果見表6。從結(jié)果看，該方法的回收率范圍為85.0%～96.2%，RSD范圍為1.2%～4.0%，均能夠滿足化妝品中4種黃曲霉毒素準(zhǔn)確測定的要求。2.5

結(jié)果討論大部分黃曲霉毒素為極性化合物，而油脂類化合物極性均較小，根據(jù)相似相溶原理，甲醇-水可以完全溶解黃曲霉毒素，且對不同劑型的化妝品基質(zhì)分散性較好，經(jīng)濟(jì)、安全，故選用甲醇-水作為提取溶劑。3

結(jié)論結(jié)論化妝品直接作用于人體表面，在滿足人們“愛美之心”的同時，其質(zhì)量也關(guān)系到人民群眾身體健康。本實驗建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）測定化妝品中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的方法，精密度及穩(wěn)定性均良好，回收率較高，可以準(zhǔn)確、高效地檢測化妝品中黃