EGFR(T790M)抑制劑的設(shè)計(jì)、合成及活性評(píng)價(jià)

引言肺癌是發(fā)病率和死亡人率最高的惡性腫瘤，源于其多藥耐藥性的層出不窮，5年存活率改善不大，維持在8%～14%，目前我國(guó)每年新發(fā)病的肺癌患者超過(guò)73萬(wàn)人，其中，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占85%左右。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超出50%的亞洲肺癌患者在治療過(guò)程中發(fā)生標(biāo)志物表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因突變，主要集中在18～21號(hào)外顯子區(qū)域，包括18/19缺失、19/20插入、L858R、G719X等，其中，T790M突變尤為顯著，占EGFR突變的60%以上。當(dāng)前，針對(duì)EGFR突變所開(kāi)發(fā)的靶向精準(zhǔn)藥物已經(jīng)發(fā)展到了第三代，奧希替尼，盡管其對(duì)T790M耐藥突變具有良好的治療效果，但仍不可避免地出現(xiàn)C797S/R和L792F/H等突變現(xiàn)象。因此，接受EGFR靶向藥物治療的患者，需定期進(jìn)行耐藥檢測(cè)以便及時(shí)調(diào)整用藥方案。2015年，研究中，指出泛激酶抑制劑依魯替尼可以較為溫和地抑制EGFR（T790M）突變的NSCLC細(xì)胞系的增殖，對(duì)H1975細(xì)胞的IC50為1.2

μmol/L。在前期研究中，針對(duì)依魯替尼的高親脂性（CLogP=4.07）、不良的水溶性和生物利用度，本課題組對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，成功獲得脂水分配系數(shù)改善的先導(dǎo)化合物B6（CLogP=2.55），實(shí)現(xiàn)體外對(duì)H1975細(xì)胞系的抗增殖活性和體內(nèi)對(duì)H1975異植瘤抑制活性均優(yōu)于依魯替尼。為了確認(rèn)化合物B6對(duì)H1975的作用活性來(lái)源，檢測(cè)了其對(duì)EGFR（T790M）激酶的抑制活性，IC50為（22.0±2.6）nmol/L，低于其對(duì)其他激酶的抑制活性，并且優(yōu)于依魯替尼（IC50=（52.0±4.3）nmol/L）；同時(shí)使用Autodock軟件對(duì)B6與EGFR（T790M）蛋白（PDB：5GNK）進(jìn)行了對(duì)接分析，如下圖所示，化合物B6不僅與該蛋白的Met793、Gln791殘基形成氫鍵相互作用；其磺酰烯基也與Cys797形成了穩(wěn)定的共價(jià)鍵，很好地解釋了B6如何使EGFR（T790M）蛋白抑制失活。為了繼續(xù)探索此類衍生物對(duì)EGFR（T790M）突變的NSCLC的治療效果，挑選生物電子等排體1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺（依魯替尼的母核）替換了B6的7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，亞甲基四氫吡咯基團(tuán)則選用同系物碎片（前期研究中所得的優(yōu)勢(shì)碎片）進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，如下圖B所示，所合成的化合物均進(jìn)行核磁共振（NMR）和質(zhì)譜（MS）結(jié)構(gòu)表征及體外生物活性確認(rèn)。正文部分1

實(shí)驗(yàn)部分1.1

主要儀器與試劑1.2

中間體2的制備1.3

（3-碘-1H-4-氨基吡唑[3,4-d]并嘧啶）（4）的制備1.4

中間體5的制備1.5

中間體6的制備1.6

中間體7的制備1.7

目標(biāo)化合物的制備1.8

目標(biāo)化合物對(duì)EGFR、EGFR（T790M）激酶活性的測(cè)試1.9

肺癌細(xì)胞系的抗增殖活性測(cè)試1.10

化合物與EGFR（T790M）蛋白的對(duì)接分析2

結(jié)果與討論2.1

目標(biāo)化合物的波譜分析目標(biāo)化合物I1～I(xiàn)3和II1～I(xiàn)I3的結(jié)構(gòu)應(yīng)用1HNMR、13CNMR和MS-ESI進(jìn)行了表征，現(xiàn)以I1為例予以說(shuō)明。根據(jù)1HNMR分析，化學(xué)位移δ

8.26，積分1個(gè)氫，單峰，為嘧啶環(huán)上的氫（-C4N2H-）；化學(xué)位移分別為7.69～7.64、7.46～7.43的兩組多重峰，積分均為2個(gè)氫，為1,4-取代苯環(huán)上的兩組對(duì)稱的氫（-C6H4-）；化學(xué)位移δ7.22～7.18的多重峰，積分為5個(gè)氫，為單取代苯基上的氫（-C6H5）；化學(xué)位移δ6.88、6.18的兩組dd峰分別來(lái)自烯鍵上的氫（-C2H3），前者積分1個(gè)氫，為端基烯碳C2的氫，后者積分2個(gè)氫，則為端基烯碳C1上的氫；化學(xué)位移δ4.86，ddd峰，積分1個(gè)氫，是4-取代哌啶基中次甲基碳上的氫（-C5NH9）；化學(xué)位移δ3.69（d）、2.96（td）、2.21（qd）、2.05（d）的峰，積分均為2個(gè)氫，分別為4-取代哌啶基中的4組亞甲基碳上的氫（-C5NH9）。從13CNMR可知，4-取代哌啶基的化學(xué)位移處于高場(chǎng)，其他碳原子出峰則位于低場(chǎng)，與化合物實(shí)驗(yàn)式相符。此外，再根據(jù)ESI-MS確定其分子量為476，確認(rèn)其結(jié)構(gòu)正確。2.2

目標(biāo)化合物的激酶活性分析目標(biāo)化合物對(duì)EGFR、EGFR（T790M）的激酶抑制活性如表1所示，取代基為苯氧基苯基取代者（I1～I(xiàn)3）的活性均明顯優(yōu)于胡椒環(huán)基取代者（II1～I(xiàn)I3）。2.3

目標(biāo)化合物與EGFR（T790M）蛋白的相互作用分析為了解釋I和II系列化合物的構(gòu)效關(guān)系，挑選了化合物I1和II1分別與EGFR（T790M）蛋白進(jìn)行了共價(jià)對(duì)接分析。如下圖a所示，兩者均可與（T790M）蛋白的Gln791、Met793殘基形成氫鍵，與Cys797形成共價(jià)鍵；不同的是，I1的苯氧基苯基較II1的胡椒環(huán)基能更好的填充（T790M）蛋白的疏水口袋（圖b），這較好地解釋了為什么I系列化合物的激酶抑制活性均明顯優(yōu)化II系列化合物，結(jié)果與化合物的CLogP值也彼此對(duì)應(yīng)。2.4

目標(biāo)化合物的抗肺癌細(xì)胞增殖活性分析為了進(jìn)一步確認(rèn)目標(biāo)化合物在體外對(duì)EGFR（T790M）的抑制活力，分別檢測(cè)了它們對(duì)EGFR（T790M）突變型細(xì)胞系H1975、野生型細(xì)胞系A(chǔ)549和另一EGFR（Del19）突變細(xì)胞系HCC827的抗增殖活性，結(jié)果總結(jié)于表2。3

結(jié)論結(jié)論經(jīng)過(guò)體外EGFR（T790M）激酶活性測(cè)試及對(duì)接分析，確認(rèn)先導(dǎo)化合物B6對(duì)H1975細(xì)胞系的抗增殖活性及異植瘤模型的抑瘤效果源于其對(duì)EGFR（T790M）的顯著抑制?；诖税悬c(diǎn)及前期研究基礎(chǔ)，以4-氨基吡唑并[3,4-d]嘧啶為原料，經(jīng)過(guò)6步反應(yīng)，合成了6個(gè)目標(biāo)化合物。其中，化合物II1對(duì)3種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的