《葡萄植株中7種植物激素含量的測定液相色譜-質譜-質譜法》

ICS65.020.01

CCSB20

GXNS

團體標準

T/GXNSXXXX—XXXX

葡萄植株中7種植物激素含量的測定

液相色譜-質譜/質譜法

Determinationof7phytohormonesingrapebyliquidchromatography-Mass

spectrometry/Massspectrometry

（征求意見稿）

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XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

廣西農產品質量安全服務協(xié)會??發(fā)布

T/GXNSXXXX—XXXX

葡萄植株中7種植物激素含量的測定

液相色譜-質譜/質譜法

1范圍

本文件描述了液相色譜-質譜/質譜法測定葡萄植株中7種植物內源激素含量的原理，規(guī)定了試劑和

材料、儀器和設備、分析步驟、結果計算和表述、精密度等的要求。

本標準適用于葡萄植株的葉、芽、果等組織中玉米素、玉米素核苷、赤霉素A3、生長素、水楊酸、

茉莉酸、脫落酸含量的測定。

本標準的方法檢出限詳見附錄A中表A.1。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

植物激素planthormone

由植物自身合成，通常自產生部位移動到作用部位，并在極低濃度下具有顯著生理作用的微量有機

物質，也被稱為植物天然激素或植物內源激素。

4原理

試樣用異丙醇混合溶液低溫震蕩提取植物激素，經反相色譜柱分離，液相色譜-質譜/質譜法進行測

定，外標法定量。

5試劑和材料

除非另有說明，本方法使用的試劑均為色譜純；水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級水。

異丙醇。

甲醇。

二氯甲烷。

鹽酸，優(yōu)級純。

異丙醇+水+鹽酸（2+1+0.003）：取20mL異丙醇（5.1）加10mL水，再加入0.03mL鹽酸（5.4），

混勻。

50%甲醇溶液：取50mL甲醇（5.2）加50mL水，混勻。

植物激素標準品：玉米素、玉米素核苷、赤霉素A3、生長素、水楊酸、茉莉酸、脫落酸，化合物

信息詳見附錄A中表A.1，純度均≥98%。

單一標準儲備液：分別準確稱取各植物激素標準品（精確至0.1mg）至棕色容量瓶中，加入甲醇

（5.2）溶解配成濃度為1000μg/mL的標準儲備溶液，于-80℃避光保存，有效期為6個月。

混合標準儲備液：分別吸取7種植物激素標準儲備液0.1mL（5.8），置于10mL棕色容量瓶中，

用甲醇（5.2）稀釋成濃度為10μg/mL的混合標準儲備液，于-80℃避光保存，有效期為3個月。

1

T/GXNSXXXX—XXXX

混合標準工作溶液：分別準確吸取一定量的混合標準儲備液（5.9）于10mL棕色容量瓶中，加

入已預冷的50%甲醇溶液（5.6）定容稀釋成濃度為0.02ng/mL~100ng/mL的植物激素混合標準工作溶

液，臨用新配。

液氮。

濾膜：0.22μm濾膜，有機相。

6儀器和設備

液相色譜-質譜/質譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。

電子天平：感量0.1mg。

渦旋混勻器。

低溫震蕩儀：溫度可至5℃。

超低溫冰箱：溫度可至-80℃。

氮吹儀。

7分析步驟

樣品制備

分別取新鮮的葡萄植株的葉、芽、果等部位供試樣，迅速用超純水洗凈樣品附著的雜物，表面水分

用吸水紙擦干，立即保存于液氮中。將樣品從液氮中取出，置于研缽中加液氮磨細，混勻，立即轉移至

-80℃冰箱避光保存。

試樣處理

稱取0.2g（精確至0.1mg）制備好的試樣于15mL塑料離心管中，加入2mL預冷（4℃）的提取

劑（5.5），置于5℃震蕩儀中以200r/min振蕩1h，再加入4mL預冷（4℃）的二氯甲烷（5.3），繼

續(xù)震蕩1h，取二氯甲烷層氮吹至近干。加入0.5mL預冷（4℃）的50%甲醇溶液（5.6）復溶，漩渦混

勻，經0.22μm濾膜過濾，濾液供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

儀器參考條件

7.3.1液相色譜參考條件

a）色譜柱：BEHC18柱，2.1mm×100mm，粒度1.7μm，或性能相當者；

b）流動相：流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序見表1；

c）流速：0.3mL/min；

d）柱溫：40℃；

e）進樣量：5μL。

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T/GXNSXXXX—XXXX

表1流動相梯度洗脫程序

時間/min流動相A體積分數(shù)/%流動相B體積分數(shù)/%

08020

65050

80100

100100

10.18020

138020

7.3.2質譜參考條件

a）離子源：ESI源；

b）掃描方式：正離子掃描模式和負離子掃描模式（參見附錄B）；

c）檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM）；

d）干燥氣、霧化氣、碰撞氣均為高純氮氣，使用前應調節(jié)各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要

求，參考條件參見附錄B；

e）監(jiān)測離子對、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)應優(yōu)化至最佳靈敏度，參考條件參見附錄B。

測定

7.4.1定性測定

在相同實驗條件下進行樣品測定時，如果樣品中待測物質的保留時間和標準工作溶液中對應的保留

時間一致（變化范圍在±2.5%以內），且樣品譜圖中待測組分監(jiān)測離子的相對豐度和濃度相當?shù)臉藴势?/p>

的相對豐度一致，允許偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對應的被測物。

表2定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度/%>50>20～50>10～20≤10

允許的相對偏差/%±20±25±30±50

7.4.2定量測定

在相同實驗條件下，將植物激素系列混合標準工作溶液由低到高濃度依次進樣分析，以被測物的峰

面積為縱坐標，以被測物的濃度為橫坐標，根據(jù)樣品含量繪制標準工作曲線，外標法定量，應使樣品溶

液中各被測物的響應值在儀器測定的線性范圍內，如果含量超過標準工作曲線范圍上限，應適當稀釋樣

液后重新測定。上述條件下，各植物激素的參考保留時間參見附錄B中表B.1，多反應監(jiān)測圖參見附錄C。

平行試驗

按7.2～7.4步驟對同一試樣進行兩次平行測定。

空白試驗

3

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除不稱取試樣外，按7.2～7.4步驟進行空白操作。

8結果計算和表述

試樣中待測物的含量按公式（1）計算：

C×V×f

ω=…………（1）

m

式中：

——試樣中待測物含量，單位為納克每克（ng/g）；

C——從標準工作曲線上得到的被測組分溶液質量濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

f——稀釋倍數(shù)；

V——定容體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）；

m——試樣質量的數(shù)值，單位為克（g）。

計算結果應扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數(shù)字。

9精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不大于其算術平均值的15%。

在再現(xiàn)性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不大于其算術平均值的20%。

4

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附錄A

(規(guī)范性附錄）

7種植物激素中英文名字（縮寫）、CAS號、方法檢出限

7種植物激素中英文名字（縮寫）、CAS號、方法檢出限見表A.1。

表A.17種植物激素中英文名字（縮寫）、CAS號、方法檢出限

序號中文名稱英文名稱（縮寫）CAS號方法檢出限/(ng/g)

1玉米素trans-Zeati（Z）1637-39-40.25

2玉米素核苷trans-Zeatin-Riboside（ZR）6025-53-20.025

3生長素Auxin（IAA）87-51-40.125

4赤霉素A3Gibberellins（GA3）77-06-50.25

5水楊酸SalicylicAcid（SA）69-72-70.125

6脫落酸AbscisicAcid(ABA）14375-45-20.25

7茉莉酸JasmonicAcid（JA）3572-66-50.125

5

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附錄B

(資料性附錄）

液相色譜-質譜/質譜參數(shù)參考條件

液相色譜-質譜/質譜參數(shù)參考條件如下：

a）離子源：電噴霧離子源（ESI）

b）掃描模式：正離子掃描模式和負離子掃描模式（參見表B.1）；

c）離子源溫度：105℃；

d）電噴霧電壓：4800V；

e）碰撞氣流量：0.75mL/min；

f）去溶劑氣流量：6L/min；

g）擋板電壓：700V；

h）去溶劑氣溫度：480℃；

i）定量離子對、定性離子對、錐孔電壓、碰撞能量見表B.1。

表B.17種植物激素的保留時間、監(jiān)測離子對、錐孔電壓和碰撞能量

保留錐孔

序英文名定量離子定性離子碰撞能量

中文名稱時間電壓

號縮寫m/zm/zV

minV

正離子掃描模式

1玉米素Z1.30220.2/136220.2/136；220.2/202.25020；14

2玉米素核苷ZR2.18352.2/136.1352.2/136.1；352.2/220.25042；20

3生長素IAA4.39176.1/130176.1/130；176.1/102.95018；40

負離子掃描模式

4赤霉素A3GA33.79345.1/143345.1/143；345.1/221.15036；36

5水楊酸SA4.98137.1/93.1137.1/93.1；137.1/65.15018；34

6脫落酸ABA6.27263.1/219.1263.1/219.1；263.1/1535014；12

7茉莉酸JA7.38209.1/59.2209.1/59.25014

6

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附錄C

(資料性附錄）

7種植物激素的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖

7種植物激素的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖如圖C.1～圖C.7。

圖C.1玉米素的MRM圖圖C.2玉米素核苷的MRM圖

圖C.3赤霉素的MRM圖圖C.4生長素的MRM圖

圖C.5水楊酸的MRM圖圖C.6脫落酸的MRM圖

7

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圖C.7茉莉酸的MRM圖

8

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由廣西大學提出。

本文件由廣西農產品質量安全服務協(xié)會歸口。

本文件起草單位：廣西大學、廣西西大檢測有限公司、廣西亞熱帶作物研究所、廣西壯族自治區(qū)產

品質量檢驗研究院、廣西思浦林科技有限公司。

本文件主要起草人：梁瓊月、黃宏飛、石梁穩(wěn)、范曉蘇、呂麗蘭、王博、何明遠、黃麗寧、裴根、

沈方科、路丹、覃雪、隆銀燕、王士偉、黃超技、梁芳婷。

I

T/GXNSXXXX—XXXX

葡萄植株中7種植物激素含量的測定

液相色譜-質譜/質譜法

1范圍

本文件描述了液相色譜-質譜/質譜法測定葡萄植株中7種植物內源激素含量的原理，規(guī)定了試劑和

材料、儀器和設備、分析步驟、結果計算和表述、精密度等的要求。

本標準適用于葡萄植株的葉、芽、果等組織中玉米素、玉米素核苷、赤霉素A3、生長素、水楊酸、

茉莉酸、脫落酸含量的測定。

本標準的方法檢出限詳見附錄A中表A.1。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

植物激素planthormone

由植物自身合成，通常自產生部位移動到作用部位，并在極低濃度下具有顯著生理作用的微量有機

物質，也被稱為植物天然激素或植物內源激素。

4原理

試樣用異丙醇混合溶液低溫震蕩提取植物激素，經反相色譜柱分離，液相色譜-質譜/質譜法進行測

定，外標法定量。

5試劑和材料

除非另有說明，本方法使用的試劑均為色譜純；水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級水。

異丙醇。

甲醇。

二氯甲烷。

鹽酸，優(yōu)級純。

異丙醇+水+鹽酸（2+1+0.003）：取20mL異丙醇（5.1）加10mL水，再加入0.03mL鹽酸（5.4），

混勻。

50%甲醇溶液：取50mL甲醇（5.2）加50mL水，混勻。

植物激素標準品：玉米素、玉米素核苷、赤霉素A3、生長素、水楊酸、茉莉酸、脫落酸，化合物

信息詳見附錄A中表A.1，純度均≥98%。

單一標準儲備液：分別準確稱取各植物激素標準品（精確至0.1mg）至棕色容量瓶中，加入甲醇

（5.2）溶解配成濃度為1000μg/mL的標準儲備溶液，于-80℃避光保存，有效期為6個月。

混合標準儲備液：分別吸取7種植物激素標準儲備液0.1mL（5.8），置于10mL棕色容量瓶中，

用甲醇（5.2）稀釋成濃度為10μg/mL的混合標準儲備液，于-80℃避光保存，有效期為3個月。

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混合標準工作溶液：分別準確吸取一定量的混合標準儲備液（5.9）于10mL棕色容量瓶中，加

入已預冷的50%甲醇溶液（5.6）定容稀釋成濃度為0.02ng/mL~100ng/mL的植物激素混合標準工作溶

液，臨用新配。

液氮。

濾膜：0.22μm濾膜，有機相。

6儀器和設備

液相色譜-質譜/質譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。

電子天平：感量0.1mg。

渦旋混勻器。

低溫震蕩儀：溫度可至5℃。

超低溫冰箱：溫度可至-80℃。

氮吹儀。

7分析步驟

樣品制備

分別取新鮮的葡萄植株的葉、芽、果等部位供試樣，迅速用超純水洗凈樣品附著的雜物，表面水分

用吸水紙擦干，立即保存于液氮中。將樣品從液氮中取出，置于研缽中加液氮磨細，混勻，立即轉移至

-80℃冰箱避光保存。

試樣處理

稱取0.2g（精確至0.1mg）制備好的試樣于15mL塑料離心管中，加入2mL預冷（4℃）的提取

劑（5.5），置于5℃震蕩儀中以200r/min振蕩1h，再加入4mL預冷（4℃）的二氯甲烷（5.3），繼

續(xù)震蕩1h，取二氯甲烷層氮吹至近干。加入0.5mL預冷（4℃）的50%甲醇溶液（5.6）復溶，漩渦混

勻，經0.22μm濾膜過濾，濾液供液相色譜-質譜/質譜儀測定。

儀器參考條件

7.3.1液相色譜參考條件

a）色譜柱：BEHC18柱，2.1mm×100mm，粒度1.7μm，或性能相當者；

b）流動相：流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序見表1；

c）流速：0.3mL/min；

d）柱溫：40℃；

e）進樣量：5μL。

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表1流動相梯度洗脫程序

時間/min流動相A體積分數(shù)/%