《飼料及飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查 膠體金免疫層析法-江西省地方標準編制說明》

一、標準制定意義

（一）介紹

黃曲霉毒素屬于二呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，其分子結構中含有1個二呋喃環(huán)和1個氧

雜萘鄰酮（香豆素）環(huán)。黃曲霉毒素難溶于水、己烷、石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、

二甲基甲酰胺等有機溶劑。在中性溶液中較穩(wěn)定，在強酸性溶液中稍有分解，易被堿或強氧

化劑破壞，在pH值9~10的強堿溶液中會迅速分解成無毒的鹽。純品為無色結晶，耐高溫，

分解溫度為268℃，紫外線對低濃度黃曲霉毒素有很強穩(wěn)定作用?，F(xiàn)已分離出AFB1、AFB2、

AFG1、AFG2、AFB2a、AFG2a、AFM1、AFM2、AFP1等18種之多，其中以AFB1的毒性和

致癌性最強。

黃曲霉毒素的產毒菌廣泛存在于花生、玉米、麥類、稻谷等糧食作物的籽粒及核桃、杏

仁等干果、禽蛋、肉、甘薯、大豆粕、奶及奶制品中。對動物有劇烈急性毒性和明顯慢性毒

性，具有很強致突變、致畸和致癌作用。AFB1是迄今為止人類所知的毒性和致癌性最強的

物質之一，其急性毒性約為三氧化二砷的68倍、氰化鉀的10倍。其損害肝臟，容易引發(fā)肝

炎、肝硬化、肝壞死等病癥。亞洲和非洲的疾病研究機構的研究表明，食物中黃曲霉毒素與

干細胞癌變呈正相關性，長時間食用含低濃度黃曲霉毒素的食物被認為是導致肝癌、胃癌、

腸癌等疾病的主要原因。黃曲霉毒素在體內還具有一定的蓄積性，長期攝入低劑量的黃曲霉

毒素能夠大大增加患肝癌的幾率。此外，黃曲霉毒素與其他致病因素（如肝炎病毒等）對人

類疾病的誘發(fā)具有疊加效應，其細胞毒作用可干擾信息RNA和DNA的合成，進而干擾細

胞蛋白質的合成，導致動物全身性損害。

（二）背景

據(jù)聯(lián)合國糧農組織（FAO）統(tǒng)計，全世界每年谷物產量的25%受到真菌毒素不同程度的

污染。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來，中國的飼料也受到霉菌污染的嚴重挑戰(zhàn)。自2006

年以來，玉米等飼料原料價格普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶使用低質飼料原料，加

上近年來氣候的變化，華北、東北地區(qū)降雨量增加，進一步加重了飼料原料中真菌毒素的污

染。而由于飼料原料和配合飼料中多種真菌毒素同時存在，在食用油等產品及牛奶中真菌毒

素污染也比較嚴重。在世界許多地方，目前真菌毒素已構成重要的食品安全問題。

真菌毒素對人類和動物健康可產生嚴重的影響，這一認識導致了許多國家在近幾十年來

制定了諸多有關食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護人類的健康，并保障生產者和貿易商

的經濟利益。隨著全球經濟一體化的進程，類似真菌毒素等涉及安全衛(wèi)生項目的限量標準，

越來越多地被利用為貿易保護主義中非關稅壁壘的重要手段。因此，為了保證食品安全，保

障消費者的健康，為了打破國外的技術壁壘，同時在合理有利的前提下，更多地樹立我國的

技術性壁壘，開展飼料中真菌毒素的檢測并建立標準方法是有效的方法之一。目前國內應用

標準檢測方法大多為儀器方法，所需儀器設備昂貴，不利于進行廣泛推廣，并且限制了很多

檢測單位高效、廣泛地開展檢測工作。建立符合中國國情的快速檢測方法標準，具有檢測快

速、簡便、靈敏、成本低等優(yōu)點，為打開市場并占領市場提供了先決條件。

（三）限量標準、檢測方法及研究現(xiàn)狀

1、限量標準

國際上，在1966年WHO/FAO率先規(guī)定了世界貿易流通食品中AFB1的最高允許量，

1

其中明確規(guī)定國際貿易的谷類作物中AFB1的含量必須在15μg/kg以下，超過此標準含量的

產品將不能投放于市場進行流通和食用。英國在1933年規(guī)定，供人類消費前需加工的進口

農產品中AFB1含量必須低于10μg/kg，供人類消費的農產品AFB1的含量低于4μg/kg。美國

在1994年重新將黃曲霉毒素的限量進行調整：用于飼養(yǎng)家禽、豬、牛、羊的花生谷物等制

品中黃曲霉毒素總量不得超過100μg/kg，飼養(yǎng)幼年產奶動物的飼料中黃曲霉毒素的總量不

超過20μg/kg；兩年后，美國聯(lián)邦政府再次規(guī)范了黃曲霉毒素食品相關的安全法律，使其對

食品或動物飼料中黃曲霉毒素的含量要求更為嚴格，它規(guī)定人類消費食品和奶牛飼料中的黃

曲霉毒素總含量必須低于15μg/kg，人類消費的牛奶中AFB1含量要低于0.5μg/kg，其他動

物飼料中黃曲霉毒素的含量要低于30μg/kg。最為嚴格的規(guī)定為歐盟國家，國家要求人類生

活的食品消費品中AFB1的含量均不能超過2μg/kg。我國目前對AFB1的限量為特殊性膳食

食品中為0.5μg/kg，其他食品和飼料中AFB1的限量依據(jù)不同來源而有所不同，飼料詳細標

準見表1。

表1我國飼料中的AFB1限量標準

產品名稱限量/(μg/kg)

玉米、花生餅（粕）、棉籽餅（粕）、菜籽餅（粕）≤50

豆粕≤30

仔豬配合飼料及濃縮飼料≤10

生長肥育豬、種豬配合飼料及濃縮飼料≤20

肉用仔雞前期、雛雞配合飼料及濃縮飼料≤10

肉用仔雞后期、生長雞、產蛋雞配合飼料及濃縮飼料≤20

肉用仔鴨前期、雛鴨配合飼料及濃縮飼料≤10

肉用仔鴨后期、生長鴨、產蛋鴨配合飼料及濃縮飼料≤15

鵪鶉配合飼料及濃縮飼料≤20

奶牛精料補充料≤10

肉牛精料補充料≤50

2、檢測方法及研究現(xiàn)狀

真菌毒素的檢測方法主要有兩種，一是將色譜技術作為基礎的物理化學檢測方法，包括

高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，而薄層層析法（TLC）由于操作過程太

復雜，國際上近些年使用這種方法檢測真菌毒素的情況越來越少；二是免疫化學檢測法，主

要指免疫親和柱法（IAC）以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。

GC可同時檢測多種真菌毒素且檢測限較低，但仍存在標準曲線線性關系不理想、測定

時需要進行衍生化、上一次進樣待測物品滯留、重復進樣變異系數(shù)大使得重現(xiàn)性較差等一系

列問題。HPLC法雖可精確進行定性定量測定，但是樣品前處理較為繁瑣、儀器昂貴而成本

高，同時需要專門的技術操作人員，因而一般用于大型企業(yè)、科研院校和專業(yè)檢測機構的定

量分析。ELISA檢測黃曲霉毒素，樣品前處理步驟簡單且可實現(xiàn)定量化，但這種生物學方

法，受環(huán)境因素影響大，所用抗體和酶特別容易發(fā)生變質，如今市場上的同一物質試劑盒檢

測結果差異性較大，穩(wěn)定性還有待提高。

2

相比較而言，膠體金免疫層析法無需大型儀器、所需輔助試劑少、交叉反應率低、試紙

條易于保存且可單份測定，避免了分析步驟繁瑣、成本高等缺點，而且因其檢測更快速、操

作更簡單，測試人員無需進行專業(yè)培訓，所以更適合食品安全快速檢測行業(yè)的快速檢驗和基

層檢測，尤其是野外和偏遠地區(qū)人員現(xiàn)場應用此項技術十分方便。

（四）制定標準的必要性和意義

1、提高農產品質量的需要

黃曲霉毒素B1是由產毒真菌產生的代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中。這些產毒

真菌分布于各級食物鏈，即使是在現(xiàn)今擁有先進的農業(yè)技術和食品加工工藝的條件下，在作

物種植、收獲、儲藏和加工過程中，仍然無法避免和防止產毒真菌的危害。隨著我國經濟快

速發(fā)展，人民群眾物質文化生活水平不斷提高，對食品安全的關注進一步提高，迫切需要相

應的檢測技術，鑒于傳統(tǒng)檢測方法的專業(yè)性要求高和成本昂貴的缺點，黃曲霉毒素B1快速

檢測技術的研究及制訂相應的檢測方法標準是非常必要的。

2、實現(xiàn)以人為本，保證廣大群眾生命健康的需要

黃曲霉毒素B1毒性很高，可通過污染谷物和那些來源于被黃曲霉毒素B1污染了的飼料

喂飼的動物性食物（如牛奶、肉和蛋）而進入食物鏈，危害人類健康。其具有致突變、致癌

性，還具有免疫毒性，其作用的靶器官主要為肝臟，可引起人類和動物的肝臟病變和致癌。

為了對國家、人民高度負責，保障人民生命安全和農村社會穩(wěn)定，研究黃曲霉毒素B1快速

檢測技術并制訂相應的檢測方法標準是非常必要的。

3、適應市場經濟和加入WTO新形勢的需要

我國已經加入WTO，我國農產品已面臨國際和國內兩個市場，為我國農產品（勞動密

集型）進入國際市場提供了很好的機遇，但國際上十分重視農產品的安全問題，而農產品易

于被真菌污染，可能存在黃曲霉毒素B1等真菌毒素殘留問題，這已成為影響出口創(chuàng)匯的最

大制約因素。由于毒素殘留超標，引起外國拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合同等事件經常

發(fā)生，給我國農產品生產者造成很大損失，并影響了我國農產品的形象。為了從源頭保證農

產品質量，提高我國農產品的競爭力，研究黃曲霉毒素B1快速檢測技術并制訂相應的檢測

方法標準是非常必要的。

二、標準制定過程

《飼料原料中黃曲霉毒素B1的快速篩查膠體金免疫層析法》標準由江西省獸藥飼料監(jiān)

察所、北京勤邦生物技術有限公司、雙胞胎（集團）股份有限公司、江西正邦科技股份有限

公司負責起草編寫。根據(jù)國家有關標準制定和修訂工作的要求，標準起草單位在《飼料原料

中黃曲霉毒素B1的快速篩查膠體金免疫層析法》的起草編制過程中，主要工作包括以下幾

個方面：

（1）詳細查閱了國內、國外有關標準和相關專業(yè)期刊上發(fā)表過的參考文獻等技術資料，

并對這些資料進行了詳細的對比，從方法的先進性、可靠性和實用性等幾個方面考慮，選取

了幾個代表性的參考資料作為標準起草中的主要技術參考文本。

（2）及時購置相關的實驗試劑、標準品和其他材料；已將AFB1與丙二胺反應得到具

有氨基官能團的半抗原；將AFB1半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白分別進行偶聯(lián)得到免疫

原和包被原；已將制備獲得的抗原通過免疫小鼠獲得AFB1單克隆抗體；建立了膠體金免疫

3

層析法的反應體系，摸索不同條件對方法進行最優(yōu)化，最終確定了最佳的檢測方法。

（3）開展多種飼料原料膠體金快速檢測方法的試驗，包括小麥、大米、黃豆、玉米、

豆粕、花生粕、DDGS，這是方法的重要步驟和關鍵環(huán)節(jié)。不同樣品用同一種方法進行試驗

和驗證，確保本檢測方法能夠靈敏、特異、準確地檢測出飼料原料中AFB1的含量。如：方

法的靈敏度，按照空白飼料原料樣品及2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg四種濃度對飼料

原料進行添加，確定檢測限；方法的準確率，通過對經驗證的陰陽性樣品進行檢測，得到本

檢測方法的假陰性率和假陽性率，盲樣測定與儀器方法的結果進行比對，確保本方法的檢測

結果可靠；方法的特異性，運用本方法對飼料原料中常見的其他真菌毒素進行檢測，確保本

方法能特異性地檢測飼料原料中AFB1殘留。

（4）在技術指標完成試驗工作之后，嚴格按照標準的格式，起草編寫標準文本內容和

編制說明內容。

三、標準制定依據(jù)

本標準是根據(jù)GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫》、GB/T

20001.4-2015《標準編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標準》的要求而進行編寫的。有關技術

內容是在參考國外有關標準及文獻的基礎上經研究、改進和驗證后制定的。

四、標準技術內容和技術指標的論證

（一）技術原理

本方法應用了競爭抑制免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，

標記抗體。硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢

向另一端滲移。在移動的過程中，會發(fā)生相應的抗原抗體反應，并通過免疫金的顏色而顯示

出來。樣本中的黃曲霉毒素B1在流動的過程中與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制了抗

體和硝酸纖維素（NC）膜檢測線上黃曲霉毒素B1-BSA偶聯(lián)物的結合，使檢測線不顯顏色，

結果為陽牲；反之，檢測線顯紅色，結果為陰性。

（二）膠體金免疫方法主要材料的制備

1、半抗原的合成及鑒定

AFB1為小分子物質，不具備免疫原性，只有反應原性，因此需要與大分子共價結合后

才能使動物免疫系統(tǒng)識別，產生相應的抗體，本實驗首先需要合成小分子半抗原與蛋白質偶

聯(lián)的人工抗原。

AFB1小分子半抗原的制備既要保留其基本結構特征，同時又要很好地與大分子蛋白結

合。本項目通過AFB1小分子結構改造獲得具有氨基官能團的半抗原，與牛血清白蛋白（BSA）

偶聯(lián)合成免疫原，與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被原。

將AFB1與丙二胺反應得到具有氨基官能團的半抗原，合成路線如下：

4

半抗原合成的具體步驟：0.10gAFB1在2mL二甲基亞砜（DMSO）中的混合物，60℃

下緩慢滴加入0.1mL1,3-丙二胺和0.1mL吡啶在2mLDMSO的混合液中，滴加完畢后，繼

續(xù)反應12h，旋蒸除去溶劑和未反應的丙二胺，定量得到AFB1的丙二胺單縮合物，即為AFB1

半抗原。

2、人工抗原的合成及鑒定

（1）免疫原的合成

將AFB1半抗原與BSA進行偶聯(lián)得到免疫原。

具體操作如下：

取AFB1半抗原20mg用2mL水溶解，得到溶液（Ⅰ），取0.5mL3%的戊二醛逐滴加入

到上述溶液（Ⅰ）中，室溫攪拌反應24h得到溶液（Ⅱ）；取50mgBSA用4mL水溶解得到

溶液（Ⅲ）；將溶液（Ⅱ）緩慢加入到溶液（Ⅲ）中，室溫攪拌反應過夜，再向攪拌后的溶

液中加入30mgNaBH4進行還原反應；用0.02mol/L的PBS透析三天，每天更換透析液三次，

得到AFB1免疫原。

（2）包被原的合成

將AFB1半抗原與OVA進行偶聯(lián)得到包被原。

具體操作如下：

取50mgOVA用4mL水溶解，得到溶液（Ⅰ）；取EDC和NHS各50mg用2mL水溶

解完全后加入溶液（Ⅰ）中，室溫攪拌反應30min，得到溶液（Ⅱ），取25mgAFB1半抗原

用3mL水溶解，得到溶液（Ⅲ）；將溶液（Ⅱ）緩慢加入到溶液（Ⅲ）中，室溫攪拌反應

24h；用0.02mol/L的PBS將攪拌后的溶液透析3天，每天更換透析液3次，得到AFB1包

被原。

（3）AFB1免疫原與包被原的鑒定

一般通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是否為有效偶聯(lián)，因為半抗原與蛋白

在紫外下有不同的特征吸收，當偶聯(lián)成功時，偶聯(lián)物的紫外吸收會有二者的迭加效應出現(xiàn)，

因此比著單獨的蛋白特征吸收會發(fā)生一定的偏移，可用于檢測偶聯(lián)是否成功。

偶聯(lián)比的測定

用pH7.4的PBS溶液稀釋AFB1半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白和兩種蛋白與AFB1

半抗原的結合物，配制成一定濃度的溶液，然后用紫外分光光度計進行全波長掃描，得到它

們的紫外吸收光譜圖。

根據(jù)公式K=A/CL分別計算出AFB1半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白的摩爾消光系數(shù)。

5

在載體蛋白和AFB1半抗原的最大波長處檢測偶聯(lián)物的光吸收值，按公式計算兩種物質在偶

聯(lián)物中的摩爾濃度比，即偶聯(lián)比：

Ca/Cb=（A偶264×KBSA280-A偶280×KBSA264）/（A偶280×KAFB1264-A偶264×KAFB1280）

蛋白含量的測定

將偶聯(lián)物稀釋到適當倍數(shù)后，測定280nm和260nm的分光光度值，按公式計算蛋白的

濃度即偶聯(lián)物的濃度：

蛋白質（mg/mL）=1.45×OD280-0.74×OD260

免疫原和包被原的鑒定結果

通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是有效偶聯(lián)，根據(jù)AFB1半抗原、載體蛋

白、偶聯(lián)物在特定波長的摩爾吸光系數(shù)估算半抗原與載體蛋白的結合比分別為15:1和18:1，

偶聯(lián)效果較好。

3、抗體的制備

（1）動物免疫

用無菌pH7.0的PBS液將合成的免疫原溶解，然后按免疫原（AFB1半抗原-BSA）與弗

氏佐劑（FCA）1:3的比例充分乳化制成油乳劑疫苗。首次免疫用弗氏完全佐劑疫苗，對8~10

周齡Balb/c小鼠進行免疫，頸背部皮下多點注射，免疫劑量為150μg/只。14天后二免，采

用弗氏不完全佐劑（FICA），免疫劑量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量

同上；31天后加強免，不加佐劑，直接采用AFB1半抗原-BSA免疫。免疫過程見表2。

表2動物免疫過程

免疫過程免疫原免疫劑量/(μg/只)間隔時間

首免AFB1半抗原-BSA（FCA）150-

二免AFB1半抗原-BSA（FICA）15014天

三免AFB1半抗原-BSA（FICA）15014天

加強免（融合前三天）AFB1半抗原-BSA1003天

（2）單克隆抗體的制備

飼養(yǎng)細胞制備：斷頸處死8~10周齡Balb/c小鼠，浸泡在75%酒精中5min，隨即放入

超凈工作臺內，腹部朝上放于平皿內或固定于解剖板上。用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用

剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下兩側做鈍性

分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mLRPMI1640基礎培養(yǎng)液，

注入小鼠腹腔，輕輕抽回注射器，晃動小鼠腿部和尾部幾次。用原注射器抽回腹腔內液體，

注入離心管。如此反復操作3~4次。1000r/min離心10min，棄上清。用20~50mL完全培養(yǎng)

液重懸細胞，100μL/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。

脾細胞制備：加強免疫后3天，取免疫Balb/c小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%

酒精中消毒后取脾臟，去除結締組織，制備脾細胞懸液，轉移到50mL離心管中，加RPMI1640

至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，加RPMI1640至30mL，計數(shù)待用。

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骨髓瘤細胞制備：取3瓶生長狀態(tài)良好的（活細胞數(shù)>95%）骨髓瘤細胞，將之完全吹

下，轉移到50mL離心管中，加RPMI1640至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，

加RPMI1640至30mL，計數(shù)待用。

細胞混合：脾細胞:骨髓瘤細胞=8:1，混合，1500~2000r/min離心5min。

細胞融合：將混合好的細胞離心，倒干上清，把沉淀細胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，

在1min內加入1mL融合劑，融合劑為聚乙二醇（PEG）4000，作用2min，并輕輕攪拌細

胞，在隨后4min內加入20mL無血清的PEG營養(yǎng)液，1000r/min離心10min，棄上清。用

20~50mL完全培養(yǎng)液重懸細胞，鋪種于含飼養(yǎng)細胞96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μL，置培養(yǎng)

箱中。

上清檢測：待細胞長至孔底的1/2~1/3時，采用間接競爭ELISA法測定細胞上清液，篩

選陽性孔。將陽性細胞在檢測后2天內采用有限稀釋法進行亞克隆。10~14天后，再取細胞

上清檢測，最終得到了穩(wěn)定分泌AFB1的單克隆雜交瘤細胞株，將此細胞株進行擴大培養(yǎng)和

傳代。

老鼠致敏：液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6~8周，注射體積500μL/只。10天后可制備腹

水。

注射細胞：收集雜交瘤細胞并用1640洗細胞兩遍，取100到150萬細胞注射于老鼠腹

腔，一周后可見老鼠狀態(tài)不活躍并且老鼠的腹腔腫大。

腹水采集：注射細胞一周后對腹腔腫大的老鼠用無菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔

一到兩天采集一次，這樣多次反復采集直到老鼠自然死亡。

單抗純化：采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化后的腹水放入-20℃環(huán)

境保存，腹水在使用前經過0.01mol/LNaCl于4℃環(huán)境下透析48h，中間每隔6~8h換液一

次。

4、膠體金的制備

（1）玻璃器皿的準備

用于實驗的所有玻璃器皿在實驗之前需要徹底清潔：將玻璃器皿先用自來水沖洗去除玻

璃器皿表面的灰塵，用酸液浸泡36h后，取出，用自來水洗凈酸液，再用蒸餾水洗3~4次，

再用去離子水把每個玻璃器皿洗三次，烤箱烘干后備用。專用的玻璃器皿用第一次生成的膠

體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸水洗凈，可以減少金顆粒的吸附，玻璃器皿的表面污染會干

擾金顆粒的生成。

（2）檸檬酸三鈉還原法

取0.01%氯金酸水溶液100mL置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高

溫、持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉水溶液2mL，繼續(xù)勻速攪拌加熱15min，溶液呈透

亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復到原體積，4℃保存。

（3）膠體金的質量鑒定

肉眼觀察：用肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好無雜質、透明度較

高，說明膠體金質量較好，結果見圖1。

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圖1肉眼觀察膠體金顏色

紫外掃描鑒定：取冷卻后的膠體金溶液進行400~600nm紫外掃描，確定最大吸收峰波長，

觀察最大吸收峰的峰形、峰寬，結果見圖2。其圖譜中最大吸收峰的峰寬較小，說明膠體金

顆粒分布比較均勻，最大吸收峰波長為523nm。

圖2膠體金的紫外/可見分光光度計掃描圖

透射電鏡鑒定：透射電鏡下觀察膠體金顆粒的大小是否均勻一致，有無橢圓形及多角形。

拍片放大后測量膠體金顆粒直徑大小，取多個點計算膠體金顆粒的平均直徑。膠體金顆粒的

透射電鏡掃描圖片見圖3。由圖3可知，在透射電鏡下觀察到膠體金顆粒的大小基本一致，沒

有橢圓形、多角形的金顆粒。將照片掃描后轉換成電子版圖片，放大后測量膠體金顆粒直徑

大小。隨機挑選10個膠體金顆粒通過計算得到金顆粒平均直徑為(20±0.5)nm。

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圖3膠體金電鏡掃描圖片

（4）膠體金溶液的準備

用0.1mol/LK2CO3調節(jié)膠體金溶液的pH值為7.2。由于金顆粒容易吸附于電極上使之堵

塞，故不能用pH計測定膠體金溶液的pH值，一般使用精密pH試紙。

5、膠體金標記抗體的制備

（1）穩(wěn)定膠體金最適抗體用量的選擇

以目測法確定穩(wěn)定膠體金的最適抗體用量。用0.1mol/LK2CO3調節(jié)膠體金溶液pH為7.2，

分裝9管，每管1mL。待標記的抗體溶液用0.01mol/L，pH7.6的磷酸鹽緩沖液作系列稀釋為

50~400μg/mL，分別取0.1mL加入2~8管的膠體金溶液中。第1管加0.1mL三蒸水，混勻。靜

置5min后，在上述1~8管中加入0.1mL10%NaCl溶液，第9管加0.1mL三蒸水，混勻后靜置2h，

觀察結果。稀釋后抗體和其他試劑操作步驟見表3，結果見表4和圖4。

表3最適蛋白用量操作步驟

管數(shù)

試劑

123456789

抗體加樣量（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1

抗體濃度（μg/mL）050100150200250300350400

膠體金（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.0

搖勻，靜置5min

10%NaCl（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10

搖勻，靜置2h后，觀察結果

備注：第1管為沒有加入抗體的對照管，其內加入0.1mL三蒸水，第9管為沒有加入氯化鈉的對照管，其內加

入0.1mL三蒸水。

表4目測法確定穩(wěn)定膠體金最適蛋白用量

管號123456789

蛋白添加量（μg）0510152025303540

9

終顏色藍灰藍灰藍灰紅藍紅紅紅紅紅

圖4膠體金與抗體比例試驗結果

由表4和圖4可知，未加抗體蛋白（1管）和加入抗體蛋白的量不足以穩(wěn)定膠體金的2~4

管，呈現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象；未加入氯化鈉的9管顏色不發(fā)生變化；而加入抗體蛋白量達

到或超過穩(wěn)定膠體金的最小蛋白用量的5~8管保持紅色不變。其中含抗體蛋白量最低的5號試

管即含穩(wěn)定1mL膠體金所需的最小蛋白用量。在此基礎上再增加20%即為待標記抗體蛋白的

實際用量，即穩(wěn)定膠體金的實際蛋白用量為每1mL膠體金溶液中添加24μg抗體蛋白。

（2）膠體金標記抗體程序

在磁力攪拌下，用0.1mol/LK2CO3調節(jié)膠體金的pH至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入

抗體24μg的標準向膠體金溶液中加入AFB1單克隆抗體，攪拌混勻10min，加入10%BSA使其

在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置10min。12000r/min，4℃離心40min，棄上清液，沉淀

物用體積為初始膠體金體積1/10的金標抗體稀釋液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.3%的表面活

性劑、10%的蔗糖，pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）重懸，置4℃環(huán)境中備用。

（3）膠體金標記抗體的鑒定

將羊抗鼠二抗點樣于NC膜上，直接與金標抗體作用，可見有明顯的粉紅色斑點，表明

金標抗體有活性。

（三）膠體金免疫方法的建立

1、固相載體的選擇

（1）吸水墊的選擇

取厚度為2.59nm，質地均勻的Cottonlinters300作為吸水墊組裝試紙條，滴加樣品后

5min觀察吸水墊的情況，樣品吸收速度較快，故選擇Cottonlinters300作為吸水墊。

（2）硝酸纖維素膜的選擇

將抗原適當稀釋后通過點樣方式分別包被在milipore135、UnisartCN140和mdi70三種

NC膜上，經干燥、組裝試紙條后，置于陰性樣品中測試觀察樣品層析速度和檢測線顯色情

況，結果見表5。

表5NC膜點樣顯色結果

NC膜型號millipore135UnisartCN140mdi70

10

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

注：＋＋＋，表示著色很深，與背景反差很大；＋＋，表示著色較深或著色很深但與背景反差較??；＋，

表示著色淡或著色較深但與背景反差很??；－，表示沒有著色，或與背景色沒有反差，表6-表22同此注釋。

由表5可知，不同孔徑及廠家的NC膜點樣后，均能顯色，但顯色程度略有不同，

UnisartCN140顯色最深，milipore135和mdi70差別不大。

不同NC膜組裝的試紙條加樣后樣品展開速度和加樣5min后的檢測線顯色結果見表6。

表6NC膜層析顯色結果

NC膜型號millipore135UnisartCN140mdi70

試劑展開速度較快慢快

5min后檢測線顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表6可知，UnisartCN140加入樣品后層析速度較慢，5min內檢測線顯色最深，milipore

135試劑展開速度較UnisartCN140快，但不及mdi70。milipore135與mdi70上檢測線顯色情

況相差不多，但mdi70背景顏色較淺。所以，綜合層析速度與顯色情況，三種NC膜中，mdi

70更符合試紙條設計要求。

（3）樣品墊的選擇

分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種不同材質材料作為樣品墊組裝試紙條，在金標墊

處滴加2μL10%的金標抗體，滴加100μL的陰性豆粕樣品，觀察樣品墊對樣品的過濾、吸收，

以及樣品在NC膜上的層析和檢測線顯色情況，結果見表7。

表7樣品墊選擇結果1

樣品墊型號BX-SB06WFBQXLM

樣品吸收情況吸收不完全吸收不完全吸收完全

檢測線顯色情況－－＋

由表7可知，BX-SB06、WFB對豆粕中各組分吸收能力非常差，使用這兩種材料作為

樣品墊檢測豆粕時檢測線沒有顯色。QXLM雖然可以較大程度地吸收、過濾豆粕的蛋白等

物質，但對于豆粕的層析速度的提高還是有較大局限性，層析速度較慢，且顯色較淺。以上

實驗說明采用卡殼形式測定豆粕等飼料原料時，使用以上三種樣品墊對于飼料原料中復雜組

分的吸收過濾效果均不顯著，除非采取稀釋的方法，否則很難得到滿意的效果。但將樣品稀

釋后再進行檢測，不但會降低產品本身的靈敏度，而且增加了操作步驟，使試紙條便捷快速

的優(yōu)勢大打折扣。所以，考慮其他反應模式對飼料原料進行檢測。

向潔凈的酶標板孔中加入10μL10%的金標抗體，再將陰性豆粕樣品200μL加入其中，

與孔內金標抗體混合均勻，分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種材質材料作為樣品墊組裝

試紙條后，手持吸水紙?zhí)?，將樣品墊端插入盛有樣品-金標抗體混合液中豎直放置，靜置5min

后觀察結果。

11

表8樣品墊選擇結果2

樣品墊型號BX-SB06WFBQXLM

樣品吸收情況吸收不完全吸收不完全吸收完全

檢測線顯色情況＋＋＋＋＋

由表8可知，采用插條方式進行檢測時BX-SB06、WFB對豆粕中各組分吸收效果依然

較差，雖然檢測線稍有顯色，但顯色很淺。QXLM作為樣品墊在插條模式中顯示出了極大

的優(yōu)勢，不但對樣品過濾效果較好，而且層析速度相對快速，檢測線顯色明顯。這種直接向

酶標板孔中滴加樣品的模式，操作簡便。所以，選擇QXLM作為樣品墊，并采用插條模式

進行檢測。

2、層析條件的選擇

（1）包被稀釋液和包被條件的篩選

分別用A、B、C、D四種不同配方的稀釋液將包被原AFB1半抗原-OVA做一定梯度稀釋，

在NC膜上點樣后烘干，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結果見表9。

表9包被稀釋液篩選結果

包被原濃度包被液

（mg/mL）ABCD

0.025－－－＋

0.5＋＋＋＋＋

1＋＋＋＋＋＋＋＋＋

2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表9可知，使用不同的包被稀釋液，試紙條顯色結果有一定差異，其中包被稀釋液D

在稀釋至0.025mg/mL時，NC膜上點樣著色照樣很深，而其他包被稀釋液在稀釋至

0.025mg/mL時，顏色很淡或不顯色，故選擇包被稀釋液D作為實際用包被稀釋液。

用包被稀釋液D將包被原稀釋至1mg/mL，在NC膜上點樣后分別置于37℃烘干和室溫

（18~25℃）下自然干燥，時間設置為30min、1h、2h、8h、12h，組裝試紙條檢測陰性豆粕

樣品，觀察顯色情況，結果見表10。

表10包被條件篩選結果

包被時間

包被條件

30min1h2h8h12h

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表10可知，點樣后，包被稀釋液在37℃烘干和室溫（18~25℃）自然干燥的不同包被

12

時間差異不顯著。為減少外界因素對試驗的影響，包被條件選擇37℃干燥8h。

（2）封閉液和封閉條件的選擇

為減少NC膜對反應的非特異性影響，采用封閉液對NC膜進行封閉，分別用A、B、C、

D四種封閉液封閉，37℃溫育30min后，用PBST洗液清洗2次，自然干燥后組裝試紙條檢測

陰性豆粕樣品，觀測膠體金在NC膜上的層析情況及檢測線的顯色情況，結果見表11。

表11封閉液篩選結果

封閉液ABCD

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表11可知，封閉液A封閉后得到的斑點顏色很深，作為背景的NC膜呈白色，同斑點

顏色反差非常大，說明封閉液A封閉效果很好，將NC膜上的一些結合位點進行了封閉，使

金標抗體不在NC膜上結合停留，除抗原點樣處為紅色外，NC膜其他位置都為白色。封閉液

C封閉后得到的斑點顏色也很深，但NC膜上呈深淺不一的粉紅色，降低了斑點同背景的反

差。封閉液B、D封閉后得到的斑點顏色較淺。說明封閉液A的封閉效果比其他三種封閉液

封閉效果好。

包被抗原點樣后，用封閉液A以不同的封閉時間30min、1h、2h、8h、12h分別在室溫

（18~25℃）、37℃條件下進行封閉，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察膠體金在NC膜上

的層析情況及檢測線的顯色情況，結果見表12。

表12封閉條件篩選結果

封閉時間30min1h2h8h12h

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表12可知，抗原點樣后，37℃封閉2~12h和室溫條件下封閉12h均能得到著色較深、背

景較淺的斑點。為縮短試驗時間、減少外界因素對試驗的影響，選擇的封閉條件為37℃封閉

2h。

（3）金標抗體稀釋液和干燥條件的篩選

分別用A、B、C、D、E五種不同配方的稀釋液將金標抗體做1:1、1:2、1:3、1:4稀釋后，

組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結果見表13。

表13金標抗體稀釋液篩選結果

金標抗體稀釋液

稀釋倍數(shù)

ABCDE

1:1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:2＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:3－＋＋＋＋－

13

1:4－－＋－－

由表13可知，五種金標抗體稀釋液顯色結果差異顯著，分析結果顯示經稀釋液C稀釋1:4

的金標抗體滴加到NC膜上時仍能顯色，而同樣情況下，其他稀釋液不顯色，故選擇金標抗

體稀釋液C作為實際用金標抗體稀釋液。

用稀釋液C將金標抗體稀釋到1:2，加入酶標板孔中，選擇表14中的5種凍干條件進行凍

干機程序方案篩選。對比5種凍干方式所得結果如表15所示。

表14金標抗體干燥條件篩選程序

程序編號

凍干條件

12345

預

凍-4℃30min0030min0

程

序-20℃1h1h01h0

-50℃3h3h3h3h3h

干

燥-20℃3h3h3h3h3h

程

序10℃00010h10h

25℃12h12h12h2h2h

表15金標抗體干燥條件篩選結果

程序編號

12345

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

凍干狀態(tài)×○○×○

注：○，代表凍干狀態(tài)良好，形狀規(guī)則，干燥完全；×，代表凍干狀態(tài)不能滿足生產需求，形狀不規(guī)則，

干燥不完全。

由表15可知，凍干程序4、5顯色均較好，3次之，1、2顯色較淺。凍干狀態(tài)2、3、5較好，

呈規(guī)則形狀，干燥完全，1、4凍干不完全，成“蜂窩”狀，容易吸潮而影響顯色。綜合顯色

與凍干狀態(tài)，選擇5號程序作為金標抗體干燥條件，與金標抗體稀釋液C配合使用。

（4）樣品墊展開劑的篩選

配制A、B、C、D、E五種不同展開劑作為樣品墊處理液，并將液體處理到QXLM上，

組裝試紙條后配合已凍干的金標抗體使用，對比五種展開劑對膠體金層析速度、樣品流動性

的作用及顯色情況。結果見表16。

表16樣品墊展開劑篩選結果

展開劑種類

ABCDE

14

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

層析速度

180165150175176

（樣本到達吸水墊的時間/s）

由表16可知，不同展開劑對樣品的流動速度及顯色差異較大。大體規(guī)律為層析速度越快，

金標抗體與C、T線有越充足的時間結合則顯色越深，不過展開劑D的層析速度較A快，但顯

色比A淺，這可能是由于D中加入的表面活性劑影響了AFB1抗原抗體的結合。綜合考慮層析

速度與顯色情況，選擇展開劑C作為樣品墊處理液適宜。

（5）C、T線包被濃度及線寬的確定

利用已確定的包被稀釋液將抗原與二抗分別進行不同倍數(shù)稀釋，并制備成試紙條檢測，

測試結果顯示：二抗或抗原濃度太低時，試紙條上的C、T線顏色偏淺，不利于觀察；抗原

濃度太高則試紙條上T線太深，與C線對比反差明顯，且對檢測靈敏度有顯著影響。通過不

斷對比試驗，綜合考慮陰性顯色程度與陽性樣品添加測試，確定在層析材料上的抗原濃度為

0.12mg/mL，線寬為0.95μL/cm，二抗?jié)舛葹?.18mg/mL，線寬為1.0μL/cm。

（四）試紙條的組裝

試紙條的結構如下所示：

加樣后的樣品流動方向

圖5膠體金試紙條結構示意圖

圖6膠體金試紙條剖面結構示意圖

注：1為樣品墊、2為NC膜、3為吸水墊、4為檢測線、5為質控線、6為PVC底板、7為保護膜

樣品墊、NC膜和吸水墊依次按順序黏貼在PVC底板上，樣品墊的末端與NC膜的始端相

連，NC膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與

底板的末端對齊；試紙黏貼有保護膜，保護膜覆蓋在樣品墊上，為檢測端，上面印有MAX

字樣。

（五）試紙條檢測過程的優(yōu)化

1、樣品提取方法的研究

在研制本方法的過程中，盡量簡化樣品前處理的步驟，力求方法更加簡單、快速。對于

飼料原料樣品，一般需要簡單的過篩、粉碎過程。試驗摸索中發(fā)現(xiàn)，粉碎后的飼料原料樣品，

15

需加入提取液進行提取，將提取后的上清液加入到磷酸鹽緩沖液中，混勻后，點樣。具體試

驗過程如下：

（1）樣品提取液的選擇

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，經過篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，分別加入15mL濃度為80%

的甲醇、氯仿、乙醇，渦動3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入200μL

0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200L進行檢測，結果見表17。

表17樣品提取液的選擇

提取液

添加濃度

甲醇氯仿乙醇

0μg/kg＋＋＋—＋

2μg/kg＋＋—＋

5μg/kg＋——

10μg/kg———

20μg/kg———

由表17可知，氯仿作為提取液時，干擾T線顯色機制而導致T線不顯色；乙醇作為提取

液時，T線顯色淺；采用甲醇提取液，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。

（2）樣品提取液體積的選擇

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，經過篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，分別加入5mL、10mL、

15mL、20mL80%甲醇，渦動3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入200μL

0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200L進行檢測，結果見表18。

表18樣品提取液體積的選擇

樣品提取液體積

添加濃度

5mL10mL15mL20mL

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋

2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋

5μg/kg＋＋＋＋

10μg/kg＋＋——

20μg/kg—＋——

由表18可知，樣品提取液體積為5mL、10mL時，提取不充分，使AFB1無法充分游離出

來，導致T線顯色淺且梯度不明顯；樣品提取液體積為15mL、20mL時，T線顯色無明顯差異，

考慮到實驗的經濟性，選擇樣品提取液體積為15mL，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)

方案。

16

（3）樣本稀釋液的選擇

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，經過篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動

3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液加入200μL樣本稀釋液（A：0.01mol/L、

pH7.2的磷酸鹽緩沖液；B：0.02mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液；C：0.05mol/L、pH7.2的磷

酸鹽緩沖液；D：0.1mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液）混勻后，取200L進行檢測，結果見表

19。

表19樣本稀釋液的選擇

樣本稀釋液

添加濃度

ABCD

0μg/kg＋＋＋＋＋＋

2μg/kg＋＋＋＋＋

5μg/kg＋＋＋＋

10μg/kg—＋＋＋

20μg/kg————

由表19可知，采用B、C、D樣本稀釋液濃度過高，T線顯色淺，且不同濃度梯度下T線

顯色無明顯梯度；采用A樣本稀釋液時，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。

（4）樣本稀釋液體積的選擇

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，經過篩和粉碎后，各稱取(5.00±0.01)g到50mL離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動

3min，室溫3000r/min以上離心5min；取100μL上清液分別加入50μL、100μL、200μL、300μL

0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液混勻后，取200L進行檢測，結果見表20。

表20樣本稀釋液體積的選擇

樣本稀釋液體積

添加濃度

50μL100μL200μL300μL

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋

2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋

5μg/kg＋＋＋＋

10μg/kg＋＋—＋

20μg/kg—＋——

由表20可知，樣本稀釋液體積為50μL時，T線顯色淺且梯度不明顯；樣本稀釋液體積為

100μL時，顯色稍加深但梯度不明顯；當樣本稀釋液體積為300μL時，檢測限濃度T線不消線；

當樣本稀釋液體積為200μL時，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方案。

由此可見，飼料原料樣品前處理方法為：試樣經過篩、粉碎后，稱取(5.00±0.01)g至50mL

17

離心管中，加入15mL80%甲醇，渦動3min，室溫3000r/min以上離心5min，取100μL上清液

加入200μL0.01mol/L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液，混勻，待檢。

2、孵育時間的研究

把金標抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測樣品。檢測前需要使用200μL經上述1處

理的待測樣品液加入微孔中充分溶解金標抗體，分別孵育1min、2min、3min、5min、8min，

之后插入試紙條，液體流動時開始計時，反應5min后觀察結果。

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，用試紙條進行檢測，結果見表21。

表21孵育時間研究結果

孵育時間（min）

添加濃度

12358

0μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

2μg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋

5μg/kg＋＋＋＋＋

10μg/kg＋＋＋—＋

20μg/kg—————

由表21可知，孵育時間為1min、2min、3min時，金標抗體與樣品反應不充分，T線顯色

淺，顯色梯度不明顯；樣品處理時間為5min、8min時，T線顯色無明顯差異，考慮到金標抗

體與樣品反應的充分性以及實驗的快速性，選擇孵育時間為5min，T線顯色深淺適中且梯度

明顯，為最優(yōu)方案。

3、顯色時間的研究

把金標抗體凍干在微孔中，組裝試紙條，檢測樣品。檢測前需要使用200μL經上述1處

理的待測樣品液加入微孔中充分溶解金標抗體，孵育5min，之后插入試紙條，液體流動時

開始計時，分別反應3min、5min、8min、10min、15min后觀察結果。

取陰性豆粕樣品，及AFB1添加濃度分別為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的陽性豆

粕樣品，用試紙條進行檢測，結果見表22。

表