征求意見(jiàn)稿《基于FFPE樣本的非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因突變高通量測(cè)序檢測(cè)方法》

1基于FFPE樣本的非小細(xì)胞肺癌相關(guān)基因突變高通量測(cè)序檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織樣本進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）相關(guān)基因突變的檢測(cè)方法和操作流程，以及本標(biāo)準(zhǔn)適用于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中涉及高通量基因測(cè)序項(xiàng)目研發(fā)和應(yīng)用的醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)、第三方檢測(cè)本標(biāo)準(zhǔn)適用于擬接受靶向治療的浸潤(rùn)性腺癌或含腺癌成分的NSCLC患者，包括IB-III期術(shù)后和晚期范疇，采用同樣的治療模式，缺乏個(gè)體化和具體的治療策略。因此本標(biāo)準(zhǔn)僅包含NSCLC相關(guān)內(nèi)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南（2023版），NCCNClinicalPracticeGuidelinesinOncology:Non-SmallGB/T42216.3—2022/ISO20166—3:2018分子體外診斷檢驗(yàn)福爾馬林固定及石蠟包埋組織檢驗(yàn)前3.1高通量測(cè)序High-throughpu又稱為二代測(cè)序（Next-generationsequencing，NGS），能3.2280%-85%，主要分為鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、3.3福爾馬林固定石蠟包埋Formalin-fixedparaffinembedde[來(lái)源：GB/T42216.3-2022/ISO20166-3.4擴(kuò)增子測(cè)序Ampliconsequ使用多對(duì)引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。引物是[來(lái)源：T/GDPMAA0012—2023高通量基因測(cè)序項(xiàng)目分類3.5探針是指能夠特異性結(jié)合靶序列且?guī)в刑厥鈽?biāo)簽的寡核苷酸單鏈。探針捕獲是指通過(guò)設(shè)計(jì)合成有3.63.7參考序列目標(biāo)區(qū)域中被樣本測(cè)序序列覆蓋的比例（測(cè)序覆蓋率=目標(biāo)區(qū)域內(nèi)測(cè)序序列覆蓋長(zhǎng)度÷參3.83.9FASTQ是基于文本的、保存生物序列（通常是核酸序列）和其測(cè)序質(zhì)量信息的、每四行表示一條序3.10SAM是基于文本的、存儲(chǔ)核酸序列和其測(cè)序質(zhì)量信息的、以每一行表示一條序列、每行以制表符分割成11列的準(zhǔn)格式，測(cè)序質(zhì)量信息使用ASCII字符表示，BAM是SAM格式的二進(jìn)制格式，SAM和BAM可作為3[來(lái)源：GB_T35890-2018，3.11堿基識(shí)別質(zhì)量Qualityofbasecal基識(shí)別錯(cuò)誤率負(fù)相關(guān)，二者遵循對(duì)數(shù)函數(shù)關(guān)系。堿基識(shí)別質(zhì)量值越高，錯(cuò)誤率越低。如Q30指測(cè)序數(shù)據(jù)中，堿基識(shí)別質(zhì)量值為30的堿基識(shí)別準(zhǔn)確率為99.9%，或錯(cuò)誤率3.12[來(lái)源：GB_T35890-2018，3.133.14單核苷酸變異Singlenucleoti簡(jiǎn)稱SNV，在基因組DNA上某一位置的單個(gè)核苷酸3.153.16拷貝數(shù)變異Copynumbervari簡(jiǎn)稱CNV，一般指長(zhǎng)度為1kb以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，通常由基因組內(nèi)的部分3.17床單基因遺傳病基因檢測(cè)報(bào)告規(guī)范》，參考并4縮略語(yǔ)CNV：拷貝數(shù)變異（CopynumbervariDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacFFPE：福爾馬林固定石蠟包埋（Formalin-fixedpaIndel：插入或缺失型變異（InsertionNGS：高通量測(cè)序/二代測(cè)序（High-throughputsequencing/Next-generatioNSCLC：非小細(xì)胞肺癌（Non-smallce4UTR：非編碼區(qū)（Untranslatedregi5實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、儀器設(shè)備及試劑最大限度地降低污染導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)根據(jù)Pre-PCR和Post-PCR階段的不同工作內(nèi)容劃分獨(dú)立格的分區(qū)，并保證無(wú)菌無(wú)RNase污染，防實(shí)驗(yàn)室的空氣流向或者通風(fēng)應(yīng)作為實(shí)驗(yàn)室防污染的強(qiáng)制要求，工作流程和空氣流向按照單一方向分子病理實(shí)驗(yàn)室建設(shè)規(guī)范》，《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作導(dǎo)則》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]1生物安全柜(Ⅱ級(jí)或Ⅱ級(jí)以上）。5文庫(kù)制備試劑：試劑盒內(nèi)至少應(yīng)包含連接頭、連接酶、聚合酶、實(shí)驗(yàn)室建設(shè)規(guī)范》，《中華醫(yī)學(xué)會(huì)肺癌臨床診療指南(2023版)》]參考國(guó)內(nèi)外肺癌相關(guān)指南和專家共識(shí)，應(yīng)至少檢測(cè)與NSCLC發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，并且與靶向治療檢測(cè)內(nèi)容應(yīng)至少覆蓋NSCLC診療中具有明確臨床意義的變異位點(diǎn)：EGFRL8ERBB2Amplification、METEx14skipping、METAmplification、ALKG1202R、NTRK1G595R、ALK/ROS1/RET/NTRK1/NTRK2/NTRK3fusion。及其變異位點(diǎn)，同時(shí)擴(kuò)展核心基因罕見(jiàn)位點(diǎn)檢測(cè)。如KRAS基因第2、3號(hào)外顯子熱點(diǎn)突變，NSCLC癌癥通Burden，TMB）用于指導(dǎo)免疫治療，則靶向測(cè)序Panel覆蓋范圍原則上不應(yīng)少于300個(gè)基因檢測(cè)，覆蓋基因組序列區(qū)域不宜<1.0Mb，并建議與外顯子組測(cè)序（WES）基因組區(qū)域應(yīng)包括但不局限于基因的編碼區(qū)、UTR區(qū)域以及基因內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生的已知熱點(diǎn)突變或?qū)＜夜沧R(shí)（2023版）》]6.2檢測(cè)方法設(shè)計(jì)鑒于DNA和RNA樣本本身的特點(diǎn)及可檢測(cè)的變異類型的差異，DNA和RNA樣本需區(qū)別對(duì)待。鑒于NGS技染色體易位/融合等?？蛇x擇采用多重PCR方法或探針捕獲方法，對(duì)相應(yīng)基因組DNA片段進(jìn)行富集。6前，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室需充分了解多重PCR方法和探針捕獲方法的優(yōu)勢(shì)和局限性，明確該檢測(cè)產(chǎn)品所采用的技和indel檢測(cè)或者基因表達(dá)水平檢測(cè)等。RNAseq分為靶向RNA測(cè)序和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；靶向RNA測(cè)序可選擇每個(gè)特定變異應(yīng)設(shè)計(jì)至少1對(duì)擴(kuò)增引物，特定基因變異的擴(kuò)增序列特異性要高，引物長(zhǎng)度一般為18至24個(gè)堿基，各引物之間不能互補(bǔ)，應(yīng)避免非特異性擴(kuò)增或引物二聚體。多重PCR的反應(yīng)體系也會(huì)影響/陽(yáng)性樣本進(jìn)行驗(yàn)證。擴(kuò)增子檢測(cè)的特定基因變異包括但不局限于EGFRT790M等每個(gè)基因/變異區(qū)域應(yīng)設(shè)計(jì)一定數(shù)目的捕獲探針進(jìn)行覆蓋，捕獲探針是指跟目標(biāo)基因序列互補(bǔ)的一段DNA或者RNA片段，通過(guò)與基因組DNA進(jìn)行雜交，將目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲并富集后，使用主流的二代測(cè)序由于基因組中的高GC、重復(fù)序列等復(fù)雜結(jié)構(gòu)的存在，有些區(qū)樣本類型為來(lái)源于非小細(xì)胞肺癌患者肺部或轉(zhuǎn)移部位腫瘤組織的FFPE樣本。樣本采集應(yīng)遵循以下7.2樣本驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)a)樣本來(lái)源：主要包括手術(shù)、纖維支氣管鏡下活檢、CT引導(dǎo)下肺穿刺、胸腔鏡、淋巴結(jié)穿刺活c)樣本外觀：FFPE蠟塊或切片，白片或蠟卷數(shù)量應(yīng)根據(jù)切片厚度和組織大小適當(dāng)增d)樣本大?。耗[瘤組織應(yīng)滿足規(guī)定的大小，用于分子檢測(cè)的穿刺樣本應(yīng)≥1條，長(zhǎng)度≥0.5cm。e)腫瘤含量：腫瘤細(xì)胞占比應(yīng)滿足檢測(cè)要求即≥20%。若腫瘤細(xì)7GB/T42216.3-2022/ISO20166-3:8.2樣本前處理以及核酸提取樣本在提取核酸前，首先檢查驗(yàn)收樣本合格，并且確認(rèn)腫瘤細(xì)胞含量滿足檢測(cè)質(zhì)控要求（建議≥核酸保存：由于DNA和RNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性存在差異，其保存條件應(yīng)獨(dú)立設(shè)置。DNA應(yīng)保存在含有Tris-HCl成分的緩沖液中，可在4℃的環(huán)境中短期保存（1個(gè)月內(nèi)），在-20℃的環(huán)境中長(zhǎng)期保存（數(shù)保存（1個(gè)月內(nèi)），在-80℃的環(huán)境中長(zhǎng)期保存（數(shù)個(gè)月到數(shù)年），如有必要還可添加RNA穩(wěn)定劑以降低8.3文庫(kù)構(gòu)建擴(kuò)增子建庫(kù)法：以DNA樣本為建庫(kù)模板時(shí)，使用特異性引物直接對(duì)基因組DNA中目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，并通過(guò)PCR或連接的方式將與二代測(cè)序平臺(tái)相匹配的接頭和區(qū)分樣本的測(cè)序標(biāo)簽添加至目標(biāo)引物取決于具體的應(yīng)用目的），然后使用特異性引物直接對(duì)cDNA中目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，再通過(guò)PCR或連接的方式將與二代測(cè)序平臺(tái)相匹配的接頭和區(qū)分樣本的測(cè)序標(biāo)簽添加至目標(biāo)序列，以制備成文庫(kù)；由于使用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)特異性比較高，對(duì)RNA樣本進(jìn)行核糖體RNA和/或珠蛋白mRNA的去除步驟并不是必須的，具體是否需要主要根據(jù)整體檢測(cè)方法對(duì)靈敏度、特中可能包括逆轉(zhuǎn)錄、片段化、一鏈/二鏈生成等多個(gè)過(guò)程，這些過(guò)程的具體順序和操作流程取決于檢測(cè)8并針對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行液相雜交捕獲和擴(kuò)增，以制備成文庫(kù)；對(duì)于來(lái)源于組織樣本的RNA，通常需要對(duì)核糖體RNA進(jìn)行去除，具體操作需要根據(jù)整體檢測(cè)方法對(duì)靈敏度、特異性等的要求和目標(biāo)而9數(shù)據(jù)處理和分析括原始測(cè)序序列FASTQ文件、待分析序列SAM/BAM文件、原始變異結(jié)果VCF文件、以及變異注釋和質(zhì)量報(bào)9.2測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制質(zhì)量控制指標(biāo)；對(duì)于檢測(cè)樣本數(shù)據(jù)，應(yīng)使用表1中建議的例9a且堿基排列完全相同的序標(biāo)區(qū)域中測(cè)序深度不低于測(cè)序片段的實(shí)際大小,即插入本的數(shù)據(jù)范圍進(jìn)行閾值設(shè)定andtheCollegeofAmericanPathologists》]10.1方案選擇可以由廠商、方法的研究和開(kāi)發(fā)者或檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室完成，目的是滿足檢驗(yàn)預(yù)期用途的特定要10.2性能驗(yàn)證10.3性能確認(rèn)時(shí)機(jī)c)核酸提取、文庫(kù)制備等方案流程的確定前應(yīng)通過(guò)性能確認(rèn)。d)數(shù)據(jù)庫(kù)建立和生信分析流程應(yīng)用前應(yīng)通過(guò)性能確認(rèn)。數(shù)據(jù)庫(kù)更新以及在原有檢測(cè)基因和變異10.4測(cè)序平臺(tái)的性能確認(rèn)10.5生物信息分析平臺(tái)的性能確認(rèn)全流程檢測(cè)，并結(jié)合計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)模擬變異的方式10.6分析性能確認(rèn)對(duì)同一批樣本在同一條件下（相同的環(huán)境、操作人員及儀器）應(yīng)至少進(jìn)行3次以上檢測(cè)，評(píng)價(jià)重復(fù)性精密度；以及不同時(shí)間、不同操作人員、不同儀器（相同型號(hào)）應(yīng)至少進(jìn)行3次以上檢測(cè)，評(píng)價(jià)再現(xiàn)性精密度。重復(fù)性精密度和再現(xiàn)性精密度評(píng)價(jià)各自的重復(fù)檢測(cè)次數(shù)至少3次，可在實(shí)驗(yàn)流程中安排同時(shí)至少使用1例樣本進(jìn)行精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)精密度的指標(biāo)包括陰陽(yáng)性在分子檢測(cè)領(lǐng)域，最低檢測(cè)限是指用該項(xiàng)分子測(cè)試技術(shù)能夠測(cè)到生物樣本中待測(cè)靶核酸分子的最質(zhì)）并進(jìn)行梯度稀釋和檢測(cè)，計(jì)算出最低檢測(cè)Sequencing-BasedOncologyPanels:AJointConsensusRecommendationoftheAssociationfor范化管理江蘇專家共識(shí)》，《實(shí)驗(yàn)室自建腫瘤全景變異檢測(cè)性能確認(rèn)中國(guó)專家共識(shí)(2024版)》]準(zhǔn)等。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或指定人員應(yīng)監(jiān)控室間比對(duì)活11.2室內(nèi)質(zhì)量評(píng)價(jià)為含有一種或多種檢測(cè)范圍內(nèi)基因和變異類型的樣本，用于監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)過(guò)程是否正常和滿足質(zhì)控要PCR或者該實(shí)驗(yàn)室正在開(kāi)展的NGS檢測(cè)方法均可。應(yīng)至少每月進(jìn)行1次檢測(cè)。如發(fā)現(xiàn)環(huán)境內(nèi)、設(shè)備上存在A.1采樣方式和注意事項(xiàng)A.1.1腫瘤組織采集發(fā)癥，且樣本需經(jīng)固定、石蠟包埋、H&E染色、免疫組化及顯微鏡鏡檢等步驟明確診斷，多個(gè)步驟會(huì)消A.1.2根據(jù)病變的位置和類型的不同，可采用以下幾種采樣方式。A.1.2.1經(jīng)氣道活檢樣本管腔內(nèi)超聲引導(dǎo)經(jīng)支氣管針吸活檢（EBUS-TB獲取樣本量更大。樣本獲取后建議進(jìn)行快速現(xiàn)d)不與氣道相通肺內(nèi)病變。尤其肺外周病變，建議選擇影像引導(dǎo)經(jīng)皮肺活檢，活檢前可行CT、增強(qiáng)CT等檢查，明確病灶有活性部建議行快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)，以評(píng)估樣本中腫瘤細(xì)胞數(shù)量及質(zhì)量。A.1.2.2經(jīng)皮壁層胸膜活檢樣本A.1.3支氣管鏡下肺癌組織樣本和細(xì)胞學(xué)樣本常見(jiàn)的取材方式包括活檢鉗活檢、支氣管刷檢和肺泡灌A.1.3.1活檢鉗活檢A.1.3.2支氣管刷檢以免鉗檢后出血，影響視野，或刷片有較多紅細(xì)胞影A.1.3.3肺泡灌洗根據(jù)影像學(xué)(主要是CT)表現(xiàn)選擇BAL（肺泡灌洗）的操作部位。BAL操作前6周內(nèi)的高分辨率CT影像是較為理想的參考依據(jù)。一般使用20ml或60ml的注射器灌注37℃左右(或室溫)的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液由操作者在可視情況下控制，一般以25～100mmHg(1mmHg＝0.133kPa)的負(fù)壓為宜。一般情況下，肺中葉或舌葉的BALF回收率約為灌入量的40%～70%，肺下葉或其他肺葉至少為30%以上。用于BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的回收液一般需達(dá)到10～20ml，最A(yù).1.4快速現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)（ROSE）b)毛刷標(biāo)本需以縱向滾移或同心圓式滾涂于玻片。巴氏細(xì)胞病理學(xué)會(huì)指南將細(xì)胞學(xué)評(píng)估結(jié)果分為5類：C1示沒(méi)A.1.5樣本后續(xù)處理A.1.5.1活檢鉗活檢標(biāo)本放在小片濾紙上，立即浸入盛有10%中性福爾馬林溶液的小瓶?jī)?nèi)A.1.5.2支氣管刷檢A.1.5.3肺泡灌洗胞完整性，然后將細(xì)胞沉渣重新懸浮于特定的細(xì)胞培養(yǎng)液中(MEM＋25mmol/LHEPES或RPMI1640+有效保存。這對(duì)于長(zhǎng)期保存組織樣本以及后續(xù)的組織學(xué)研究和病理學(xué)診斷非常重A.2.1腫瘤組織脫鈣含骨或鈣化組織的樣本需用弱酸（如甲酸）或螯合劑（如EDA.2.2腫瘤組織固定固定液應(yīng)選擇中性福爾馬林緩沖溶液（使用磷酸鹽緩沖溶液PBS配制），體積至少應(yīng)為待固定組織體積A.2.3腫瘤組織脫水應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序定期更換脫水機(jī)內(nèi)的脫A.2.4FFPE樣本制作組織碎屑；切片數(shù)量應(yīng)滿足上機(jī)要求(≥10張）；檢測(cè)前應(yīng)進(jìn)行H&E染色評(píng)估腫瘤細(xì)胞含量，腫瘤含量應(yīng)達(dá)到20%以上，最佳含量為30%以上，腫瘤細(xì)胞體積至少達(dá)到A.2.5FFPE樣本保存檢測(cè)不超過(guò)2年為最優(yōu)；白片可短時(shí)間室溫或較長(zhǎng)時(shí)A.2.6FFPE樣本運(yùn)輸《肺癌小樣本取材相關(guān)問(wèn)題的中國(guó)專家共識(shí)》；《肺癌小活檢標(biāo)本病理診斷規(guī)范專家共識(shí)》]3.科學(xué)數(shù)據(jù)表明，部分患者不存在明確的基因突變，因此未檢測(cè)到基因突變的檢測(cè)結(jié)果是是完全無(wú)用的信息，并不能證明所有的治療方法有效或無(wú)效，它能夠證明在本次樣本中不4.檢測(cè)報(bào)告根據(jù)基因突變情況提示用藥相關(guān)性，報(bào)告不能作為一個(gè)完整的診斷報(bào)告，不具備醫(yī)囑5.由于不可抗拒因素（包括但不限于病人不良的身體狀況、采血量不達(dá)標(biāo)、采血管破裂、法順利進(jìn)行，受檢者可能需要配合檢測(cè)機(jī)構(gòu)再次取樣（如果因樣本運(yùn)輸或其他非檢測(cè)原因造成的6.受檢者的個(gè)人識(shí)別信息、健康信息及檢測(cè)數(shù)據(jù)在檢測(cè)過(guò)程中將按照中國(guó)相關(guān)法律法規(guī)及政策保護(hù)及慎重使用。簽署本知情同意書(shū)即表明您同意授權(quán)檢測(cè)機(jī)構(gòu)將您的樣本及數(shù)據(jù)在匿名狀態(tài)下*腫瘤類型*臨床分期*外周血：____ml，EDTA抗凝____管，BCT無(wú)創(chuàng)____管）：B.2.1送檢樣本必須為10%的中性福爾馬林固定的樣本，建議于離體后30分鐘內(nèi)被固定（最長(zhǎng)不超過(guò)1B.2.3檢測(cè)用腫瘤細(xì)胞含量應(yīng)≥20%，建議腫集，同時(shí)送檢H&E片1張或加送白片1張用于H&E染色后進(jìn)行腫瘤含量B.2.6若為穿刺組織或腫瘤切面較小，需適當(dāng)增加送檢白片或蠟卷數(shù)量，保證組織樣本抽提獲得的DNB.2.7為保證成功率，請(qǐng)盡可能送檢一年以內(nèi)的FFPE樣本GB/T42216.3-2022/ISO20166-3:2），[5]NCCNClinicalPracticeGuidelinesin[8]GB/T42216.3-2022/ISO20166-3:[18]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)工作導(dǎo)則（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]194號(hào)）Pathol.2010,220(2):244fromformalin-fixedparaffin-embeddedspecimens.CancerSci.2019,110(4):），experimentalworkflow:upto100-plexmultiplicity.BMCGenomics.2021,22(1):835.ClinicallyRelevantMolecularProfilesinNon-Small-CellLungCancer:ResultsofExperienceon1343Samples.JMolDiagn.2018,2GenomeBiol.2009,10(10):R116.[30]高通量測(cè)序技術(shù)臨床規(guī)范化應(yīng)用北京專家共識(shí)（第一版腫瘤部分），中華醫(yī)學(xué)雜志,[32]UpdatedMolecularTestinAssociationforMolecularPathology.ArchPatholLabMed.2018,142(3):321-346.diagnosis,treatmentand