NY∕T 402-2016 脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術(shù)規(guī)程

2016-11-01發(fā)布2017-04-01實施中華人民共和國農(nóng)業(yè)部發(fā)布I——NY/T402—2000。1NY/T402—2016脫毒甘薯種薯(苗)病毒檢測技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)適用于脫毒甘薯種薯(苗)的甘薯羽狀斑駁病毒(Sweetpotatofeatherymottlevirus,脫毒組培苗vifg-freetissuecultureplant由莖尖分生組織培養(yǎng)獲得的末受甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯潛隱病毒(SPLV)、甘薯G病2.23檢測對象23.3甘薯G病毒(SPVG)?！?0000株100株>10000株3NY/T402—2016用NCM-ELISA或指示植物法進行檢測，其中10%以上(含)樣品分別利用PCR和RT-PCR方法檢測。帶毒率為0。用NCM-ELISA或指示植物進行檢測，其中5%以上(含)的樣品分別利用PCR和RT-PCR方法檢用NCM-ELISA或指示植物進行檢測，其中1%以上(含)的樣品分別利用PCR和RT-PCR方法檢測。SPFMV、SPLV、SPVG和SPCFV的帶毒率≤10.0%,SPCSV和Sweepoviruses的帶毒率為0,病毒病顯癥率≤5.0%。4在800mL無菌蒸餾水電溶解292.2gNaCl,定容至1L。4℃保存?zhèn)溆肁.1.6封閉緩沖液O工5NY/T402—2016將干燥后的膜浸入封閉緩沖液中，室溫下?lián)u床振蕩1h,50r/min。將膜置于用抗體緩沖液稀釋至工作濃度的病毒特異性抗體溶液中，室溫下?lián)u床振蕩10h～12h,50用洗滌緩沖液洗膜4次每次搖床振蕩3mn.80r/minA.3.5與二抗反應(yīng)A.3.8終止反應(yīng)工67正向引物BM-V:5'-KSGGGTCGACGTCATCAATGACGTTRTA8PCR擴增體系具體如下：dNTP(2.5mmol/L)ExTaqDNA聚合酶(5U/pL)總體積PCR擴增程序為：預(yù)變性預(yù)變性復(fù)性延伸充分延伸擴增產(chǎn)物用于后續(xù)凝膠電泳試驗。35個循環(huán)C.3.3PCR產(chǎn)物的電泳檢測制備1.0%瓊脂糖凝膠板(見C.1.3。在電泳槽中加入TAE電永緩沖液。每仁樣品取10μLPCR產(chǎn)物與10μL10×加樣緩沖液混合后，加入到凝膠孔中進行電泳恒壓(120w150V)下電泳20min～30min,將凝膠放到凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。C.3.4試驗成立的條件PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，陽性對照在預(yù)期大小(2800bp)的位置出現(xiàn)特異性條帶過時，陰性對照和空白對照均沒有出現(xiàn)預(yù)期大小的特異性條帶C.3.5結(jié)果判定應(yīng)用本標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法對待檢樣品進行檢測，如果在2800bp對應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，則判定樣品為Sweepoviruses病毒陽性，否則判定樣品為該病毒陰性9D.1.1DEPC水和C.1.3。0.5μLD.3.3PCR擴增