(高清版)GB∕T 38579-2020 生物產(chǎn)品中光合細(xì)菌測定

ICS07.080A21中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)生物產(chǎn)品中光合細(xì)菌測定國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會GB／T38579—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院、江漢大學(xué)、北京工商大學(xué)、武漢明了生物科技有限公司、北京薩姆伯科技有限公司。Ⅰ1GB／T38579—2020生物產(chǎn)品中光合細(xì)菌測定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了生物產(chǎn)品中光合細(xì)菌的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于生物產(chǎn)品中深紅紅螺菌（黃褐紅螺菌沼澤紅假單胞菌莢膜紅細(xì)菌和球形紅細(xì)菌的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1生物產(chǎn)品利用生物技術(shù)獲得的產(chǎn)品。注：本標(biāo)準(zhǔn)中的生物產(chǎn)品特指含光合細(xì)菌的產(chǎn)品。3.2光合細(xì)菌具有原始光能合成體系的原核生物，能在厭氧條件下進(jìn)行不放氧光合作用細(xì)菌的總稱。變形菌綱(紅螺菌目(根瘤菌目(紅桿菌目(包括深紅紅螺菌、黃褐紅螺菌沼澤紅假單胞菌、莢膜紅細(xì)菌和球形紅細(xì)菌等。3.3多核苷酸多態(tài)性一段核苷酸區(qū)域內(nèi)多個核苷酸引起的序列多態(tài)性。將待分離的樣品進(jìn)行稀釋后，接種于選擇性培養(yǎng)基中，由單個細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落。根據(jù)平板的菌落數(shù)及挑取菌落的生理生化、MNP鑒定結(jié)果，對生物產(chǎn)品中的光合細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。5試劑或材料本方法所用試劑均為分析純，除特殊說明外，實(shí)驗(yàn)用水均為GB/T6882規(guī)定的二級水。2GB／T38579—20205.1AT培養(yǎng)基：參見附錄A中A.1。5.2光合細(xì)菌分離瓊脂：參見A.2。5.5多重PCR擴(kuò)增與文庫構(gòu)建試劑盒。5.6高通量測序試劑盒。6儀器設(shè)備光照恒溫培養(yǎng)箱天平精度為6.3高通量測序儀。6.7微需氧培養(yǎng)罐：能維持1%氧濃度的透明培養(yǎng)容器裝置。無菌錐形瓶容量顯微鏡最低樣品的采集應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。采樣過程應(yīng)遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。7.2.1應(yīng)在同一批次產(chǎn)品中采集樣品，每件樣品的采集量應(yīng)滿足微生物指標(biāo)檢驗(yàn)的要求，一般不少于7.2.2獨(dú)立包裝不大于500g的固體產(chǎn)品或不大于500mL的液態(tài)產(chǎn)品，取完整包裝。7.2.3獨(dú)立包裝大于500mL的液態(tài)產(chǎn)品，應(yīng)在采樣前搖動或用無菌棒攪拌液體，使其達(dá)到均勻后采集適量樣品，放入無菌采樣容器內(nèi)作為一件樣品。7.2.4獨(dú)立包裝大于500g的固體產(chǎn)品，應(yīng)用無菌采樣器從同一包裝的不同部位分別采取適量樣品，放入同一個無菌采樣容器內(nèi)作為一件樣品。7.3采集樣品的貯存和運(yùn)輸7.3.1應(yīng)盡快將樣品運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。7.3.2應(yīng)在運(yùn)輸過程中保持樣品完整。7.3.3應(yīng)在接近原有貯存溫度條件下貯存樣品，或采取必要措施防止樣品中微生物數(shù)量的變化。GB／T38579—20208試驗(yàn)步驟8.1.1固體樣品：稱取25g樣品置于盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打制成的樣品勻液。8.1.2液體樣品：取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無8.1.3取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注入盛有9mL磷酸緩沖液的無菌試管中，振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1∶100樣品勻液。依次稀釋，制備10倍系列稀釋樣品勻液。8.1.4將15mL~20mL光合細(xì)菌分離瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，根據(jù)對樣品中光合細(xì)菌數(shù)量的估計(jì)，選擇8.1.3中2個~3個連續(xù)的適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液每個稀釋度接種2個無菌平皿，準(zhǔn)確吸取1mL均勻涂布于分離培養(yǎng)基上。8.1.5待8.1.4中接種物完全被培養(yǎng)基吸收后，將5mL~10mL冷卻至46℃以下的光合細(xì)菌分離瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿中，并轉(zhuǎn)動平皿使其完全覆蓋住下層的培養(yǎng)基。待瓊脂凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)置于微需氧培養(yǎng)罐中30℃±1℃光照培養(yǎng)5d。8.3.1可用肉眼觀察，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的棕紅色菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(colony-表示。8.3.2選取菌落數(shù)在30~300之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。8.3.3其中一個平板有較大片狀菌落生長時，不宜采用，應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個平板后乘以2,代表一個平板菌落數(shù)。8.3.4當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，將每條單鏈作為一個菌落計(jì)數(shù)。8.4光合細(xì)菌的鑒定8.4.1菌落挑選和純培養(yǎng)挑取計(jì)數(shù)平板上5個（小于5個全選）菌落大、紅色、棕色或黃色、表面光滑、質(zhì)地柔軟、邊緣整齊的菌落分別接種于光合細(xì)菌分離瓊脂平板，置微需氧培養(yǎng)罐中，30℃±1℃光照培養(yǎng)2d~3d。8.4.2MNP法鑒定提取純培養(yǎng)中單菌落基因組DNA,將其進(jìn)行純化。提取與純化的DNA溶液在260nm與230nm處的吸光度值的比值大于2.0;在260nm與280nm處的吸光度值的比值介于1.7與1.9之間；DNA電泳主帶明顯，無明顯降解；無明顯RNA殘留。34GB／T38579—2020擴(kuò)增與文庫構(gòu)建按多重PCR擴(kuò)增與文庫構(gòu)建試劑盒的說明書進(jìn)行DNA質(zhì)控、多重PCR擴(kuò)增、文庫構(gòu)建與純化，且多重PCR的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不高于20個。按高通量測序試劑盒和高通量測序儀的操作說明進(jìn)行高通量測序與測序質(zhì)控。高通量測序的平均覆蓋倍數(shù)設(shè)置為700倍以上，測序長度大于標(biāo)記引物在參考基因組上的擴(kuò)增長度。利用光合細(xì)菌鑒定軟件將樣品的測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組的標(biāo)記位點(diǎn)上，統(tǒng)計(jì)標(biāo)記位點(diǎn)的平均覆蓋倍數(shù)C1。當(dāng)C1<500時，判定樣品的測序數(shù)據(jù)量不足，從8.4.2.2或之前的步驟開始重新實(shí)驗(yàn)。當(dāng)C1≥500時，判定測序數(shù)據(jù)合格。利用光合細(xì)菌鑒定軟件統(tǒng)計(jì)光合細(xì)菌的檢出標(biāo)記的數(shù)目N，并輸出判定結(jié)論。若N=0,判定結(jié)論為“待測菌落不存在該光合細(xì)菌”。若N=1或N=2,判定結(jié)論為“待測菌落中可能存在該光合細(xì)菌”。若N≥3,判定結(jié)論為“待測菌落中存在該光合細(xì)菌”。對于判定結(jié)論為“待測菌落中可能存在該光合細(xì)菌”的樣品。樣品準(zhǔn)備、核酸提取、多重PCR擴(kuò)增與高通量測序應(yīng)在規(guī)定的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行操作且保持實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好。不同區(qū)域的儀器和設(shè)備應(yīng)專用。挑取純培養(yǎng)物，進(jìn)行染色鏡檢，紫色非硫細(xì)菌形態(tài)特征見附錄C中的C.1。8.4.4碳源利用試驗(yàn)將純培養(yǎng)物分別接種于含有不同碳源的AT培養(yǎng)基中，30℃±1℃光照培養(yǎng)3d~5d。紫色非硫細(xì)菌中代表屬種的生理生化鑒定特征見附錄C。8.5試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理每個平板中光合細(xì)菌菌落的計(jì)算見式(1):式中：a—每塊平板上的光合細(xì)菌菌落數(shù)；b—挑取后經(jīng)證實(shí)為光合細(xì)菌的菌落數(shù)；A—挑取平板上用于驗(yàn)證的菌落數(shù)；5GB／T38579—2020C—平板上的所有特征菌落數(shù)。8.5.2菌落總數(shù)的計(jì)算方法8.5.2.1若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（毫升）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。8.5.2.2若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時，按式(2)計(jì)算：式中：N—樣品中某一種光合細(xì)菌的活菌數(shù)；ΣC—平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1—第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2—第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d—稀釋因子（第一稀釋度）。8.5.2.3若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU,應(yīng)對稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。8.5.2.4若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU,應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。8.5.2.5若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。8.5.2.6若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU~300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。8.6菌落總數(shù)報告8.6.1若N為0,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告。8.6.3菌落數(shù)大于或等于100CFU時，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。8.6.4若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，報告菌落蔓延。8.6.5若空白對照上有菌落生長，此次檢測結(jié)果無效。g為單位報告，體積取樣以CFU/為單位報告。6GB／T38579—2020附錄A（資料性附錄）培養(yǎng)基A.1AT培養(yǎng)基成分碳源10mmol/LNaHCO3ONaCl蒸餾水A.1.2微量元素添加液NiCl2·6H2OMnCl2·4H2OZnCl2·5H2O鹽酸調(diào)節(jié)為2~3,定容至1L。對-氨基苯甲酸生物素蒸餾水100mL7GB／T38579—2020經(jīng)0.22μm水相濾膜過濾，保存在無菌容器中，冷藏保存。A.1.4抗壞血酸添加液蒸餾水100mL經(jīng)0.22μm水相濾膜過濾，保存在無菌容器中，冷藏避光保存。A.1.5AT培養(yǎng)基制法臨用前，1000mLA.1.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加1mL微量元素添加液、1mL維生素添加液和10mL抗壞血酸添加液，調(diào)節(jié)pH6.9±0.1,培養(yǎng)基經(jīng)0.22μm水相濾膜過濾，分裝到13mL滅菌螺口試管中，每管裝液12mL。光合細(xì)菌分離瓊脂A.2.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基溶液瓊脂粉蒸餾水A.2.1.2乙二胺四乙酸鐵鈉溶液Na2-EDTA蒸餾水mLA.2.2基礎(chǔ)培養(yǎng)基制法除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，pH6.9,加入瓊脂，加熱溶解，定量分裝適宜容器，121℃高壓滅菌15min。8GB／T38579—2020A.2.3光合細(xì)菌分離瓊脂制法臨用前，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基融化，保溫于46℃水浴，1000mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5mL抗壞血酸添加液。搖勻后備用。A.3磷酸鹽緩沖稀釋液磷酸二氫鉀蒸餾水用大約175μL1mol/L氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH至7.2,用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱中。用蒸餾水稀釋1.25mL貯存液至1000mL,分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。A.4革蘭氏染色法A.4.1結(jié)晶紫染色液20mL80mL95%乙醇1%草酸銨水溶液將結(jié)晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.4.2革蘭氏碘液碘碘化鉀蒸餾水將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。沙黃9GB／T38579—2020乙醇蒸餾水90將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。水洗。水洗。乙醇脫色，約30水洗；或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂水洗，待干，鏡檢。A.4.4.5結(jié)果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。GB／T38579—2020附錄B（規(guī)范性附錄）MNP標(biāo)記引物MNP標(biāo)記引物見表B.1。表B.1MNP標(biāo)記引物名稱標(biāo)記位點(diǎn)編號引物類別引物序列(端）沼澤紅假單胞菌1正向引物GATGGGCGTCAAGGTCGA反向引物ACCGGCTTCGGCATGAA沼澤紅假單胞菌2正向引物ATCAAGATCAACCACGAGACCCA反向引物GAGACGTGGATCAGGCCTTC沼澤紅假單胞菌3正向引物CGGGTGCTGATGATGCTGT反向引物ACGCCGTCGGTGCTTAAA沼澤紅假單胞菌4正向引物TCTTGCCGACCACGATCG反向引物CGACCGAAGTCGAGGTCAAG沼澤紅假單胞菌5正向引物GGCGAAATCGTCGCCTG反向引物GAGCACGCTTTGGACGAAC沼澤紅假單胞菌6正向引物ATCAACGCCTTCACCAACCC反向引物CGGACCCGGATCGATCTTG沼澤紅假單胞菌7正向引物GGCACGCTGTTCACCTTC反向引物CTTGATGTCGCCCTTGGC沼澤紅假單胞菌8正向引物TAACGGCTGGCATTCATCGTTTA反向引物TGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGCA沼澤紅假單胞菌9正向引物CCTGCTCGTCGGTCTTCATG反向引物CGGTTGAACTCGCAGCTGAT沼澤紅假單胞菌正向引物AAGTGGTGCTGGTCGGC反向引物CGAGAACACCTGGCTCTTCTTG沼澤紅假單胞菌正向引物CGGCACTTCCATGCCGA反向引物GTCAACTTCGAAGAGCCGC莢膜紅細(xì)菌正向引物GGGAAATTGGAATGGGCGAAGAT反向引物GGTCGATCAGCGTGCTGAA莢膜紅細(xì)菌正向引物GGAAGCGCGTCTGTTCAAATAC反向引物TCGATGACCTTCCAGTTGATGAATTC莢膜紅細(xì)菌正向引物ATGCGGGAACGCGCAGATA反向引物ATGGTCGGAGCGAGAGGATGB／T38579—2020名稱標(biāo)記位點(diǎn)編號引物類別引物序列(端）莢膜紅細(xì)菌正向引物CGCGCAATACTACATGAACCAC反向引物CCATGCCCAGACGTTCTTTCTT莢膜紅細(xì)菌正向引物TAGCGCACCACATCCTCG反向引物ATCCCGGTGGCGGTGAAGA莢膜紅細(xì)菌正向引物CTGATCTTTGACGCCTGCG反向引物AGGTGAATGCCCAGCGC莢膜紅細(xì)菌正向引物TTGACCACCTGCACCAGCAT反向引物AGCATGACCACGATCACCATG莢膜紅細(xì)菌正向引物CGGTCTGGGCAAGACCTA反向引物GCTTGCCCAGATAGGTCGA莢膜紅細(xì)菌正向引物GCGATGCTGCGCAAGAAC反向引物GTCGGCCTTCACCACCAGAC莢膜紅細(xì)菌正向引物GCCTGCAAGCGCAAGATC反向引物CCGATCATCACCACTTCAAGC莢膜紅細(xì)菌正向引物GCGGCATCTTTGCCGAA反向引物GCGACGATATTGGGCAGC球形紅細(xì)菌正向引物TCGATCTGGTCGAGGCCA反向引物ACATGGCGACGCCCATG球形紅細(xì)菌正向引物TCCAGTCCTCGAAGGTGCT反向引物CATAGCCGAGGTAGCCGT球形紅細(xì)菌正向引物CGACATGCGGTTGTTCTCGA反向引物GTGATCGTGGATGGCTGGTT球形紅細(xì)菌正向引物ACCCGGATCCAGACCTTCG反向引物GCAGGATCACCCGGATCTC球形紅細(xì)菌正向引物TTGCCCATGCCGAGGATCG反向引物GCTTGCACAGGATGGCC球形紅細(xì)菌正向引物GCGTCGATCAGGTCCATCT反向引物ATCGCCGTCGATGACGGGA球形紅細(xì)菌正向引物GCTTCGGCGATCGGCTT反向引物TTCACTACGGCCACCAGACC球形紅細(xì)菌正