臨床微生物檢驗(yàn)1

。DNA、放線菌、螺旋體、支真核細(xì)胞型微生物(細(xì)胞核分化程度高，有核膜、核仁，細(xì)胞器完整，包括真菌和原蟲)非細(xì)胞型微生物(僅有一種核酸類型，包括病毒、亞病毒、朊粒)拮抗外來(lái)病原微生物和提供某些營(yíng)養(yǎng)物的作用。位改變或寄居微生物叢平衡失調(diào)，能引起內(nèi)源性感染。)5.重視和加強(qiáng)與臨床的聯(lián)系踐。要是由于處理感染性物質(zhì)時(shí)的操作不當(dāng)造成的。8.消毒(disinfection)：通過(guò)物理或化學(xué)方法去除或殺滅大多數(shù)微生物的過(guò)程。滅菌(sterilization)：通過(guò)物理或化學(xué)方法殺滅或去除所有微生物的過(guò)程。消毒滅菌技術(shù)包括：熱力(濕熱滅菌和干熱滅菌)、化學(xué)(液體或氣體)、輻射(γ輻射和紫外線)、過(guò)濾技術(shù)。皮膚和軟組織感染，眼和結(jié)膜感染、子宮內(nèi)膜炎、產(chǎn)后生殖道感染，胃腸炎、肝炎等。2.臨床常見采血指征：1發(fā)熱(>38。C)或低溫(36。C)2寒戰(zhàn)3白細(xì)胞增多(計(jì)數(shù)大于12，000109/L，特別有“核左移”未成熟的或桿狀核的白細(xì)胞)4粒細(xì)胞減少(成熟的多核白細(xì)胞<1000109/L)5血小板減少6皮膚粘膜出血7昏迷，休克8多器官衰竭9CRP告流程1.壓滴法(濕片法)→不可有氣泡和外溢觀察于觀察厭氧菌的動(dòng)力熒光染色、特殊染色(鞭毛染色和莢膜染色)個(gè)原理，操作步驟與臨床意義復(fù)合物不易滲出。革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較疏松，肽聚糖層薄，含脂質(zhì)多，易被乙醇溶解，使細(xì)胞壁通透性增加，胞內(nèi)結(jié)晶○3等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)：革蘭陽(yáng)性菌的等電點(diǎn)(pH2~3)比格蘭陰性菌(pH4~5)低，在相同pH的條件下，革蘭陽(yáng)性菌比革蘭陰性菌所帶的負(fù)電荷(高層、斜面、高層斜面、平板)○1需氧培養(yǎng)法(37℃，18~24h)二氧化碳培養(yǎng)法：二氧化碳培養(yǎng)箱和燭缸法厭氧培養(yǎng)法(一)碳水化合物的代謝試驗(yàn)1.糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)(1)原理：不同細(xì)菌分解糖(醇、苷)的酶各異，代謝能力產(chǎn)物各不同，有的不分解，有的僅產(chǎn)酸，有的既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，利用此特點(diǎn)鑒(2)培養(yǎng)基：0.5~1.0%糖類等，內(nèi)有指示劑。細(xì)菌接種糖發(fā)酵管，37℃、24h孵育后觀察結(jié)果結(jié)果判斷：有的細(xì)菌能分解某些糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣(AG/+)，有的只能產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣(A/+)，有的則不能分解糖類(N/-)★2.葡萄糖代謝類型鑒別試驗(yàn)(O/F試驗(yàn))在無(wú)氧環(huán)境下不能分解葡萄糖，稱為氧化型;在分解葡萄糖的過(guò)程中，可以萄糖；不分解葡萄糖的細(xì)菌稱為產(chǎn)堿型。HL培養(yǎng)基(O/F氧化-發(fā)酵培養(yǎng)基)h結(jié)果O加液體石蠟變色；F有氧或無(wú)氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，兩管均變色N氧或無(wú)氧的環(huán)境中都不能分解葡萄糖，兩管均不變色K—開放管變藍(lán)，封閉管不變色3.β-半乳糖苷酶試驗(yàn)(ONPG)(1)原理：具有β-半乳糖苷酶的細(xì)菌，可分解鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)，生成黃色的鄰-硝基酚，在很低濃度下亦可檢出。(2)試劑：0.75MONPG溶液(4)應(yīng)用：迅速或遲緩分解乳糖的細(xì)菌ONPG試驗(yàn)為陽(yáng)性，而不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。主要用于遲緩發(fā)酵乳糖菌株的快速鑒定aβ-半乳糖苷酶，可將乳糖分解糖快速運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)所以需幾天乳糖才能被分解。苷水解試驗(yàn)(1)原理：有的細(xì)菌可將七葉苷水解成七葉素和葡萄糖，前者與二價(jià)鐵離子反應(yīng)，生成黑色化合物(2)培養(yǎng)基：七葉苷培養(yǎng)基、膽汁七葉苷培養(yǎng)基(3)方法及應(yīng)用：腸球菌陽(yáng)性，其他鏈球菌陰性★5.甲基紅試驗(yàn)(MR)一步分解成甲酸、乙酸、乳酸等PH4.5以下，加入甲基紅試劑顯紅色(陽(yáng)性)。如果酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)(醇、酮、醛、氣體和水)，或丙酮酸按PH在6.2以上，加入甲基紅試劑呈黃色(陰性)?！?.V-P試驗(yàn)VP的代謝試驗(yàn)(1)原理：細(xì)菌分泌的明膠酶(胞外蛋白水解酶)能分解明膠使明膠失去凝固能力而液化(3)應(yīng)用：a腸桿菌科細(xì)菌鑒別b厭氧菌鑒定c非發(fā)酵菌鑒定常用★2.吲哚試驗(yàn)(靛基質(zhì)試驗(yàn))成吲哚(靛基質(zhì))，吲哚與加入試劑對(duì)位二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲酶試驗(yàn)②方法：將待檢菌接種于尿素培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，不變色(橙色)為陰性 脫氨酶試驗(yàn)羧酶試驗(yàn)★方法及結(jié)果：將待檢菌分別接種于氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基(含葡萄糖、精氨酸或鳥氨酸或賴氨酸，指示劑為溴甲酚紫)和氨基對(duì)照管 對(duì)照管為黃色，若培養(yǎng)基由黃色變?yōu)樽仙珵榘被崦擊让冈囼?yàn)陽(yáng)性，若僅發(fā)酵葡萄糖顯黃色者為陰性。測(cè)定管由淡桔黃變紫(溴甲酚紫) (三)碳源利用試驗(yàn)枸櫞酸鹽(丙二酸鹽)利用試驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌能枸櫞酸鹽(丙二酸鹽)為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，將其分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，指 為深藍(lán)色。 用于腸桿菌科細(xì)菌屬間的鑒定 (四)各種酶類試驗(yàn)★1.氧化酶試驗(yàn)使對(duì)苯二胺氧化，生成有色琨類化合物(二甲基為紅，四甲基為藍(lán))。★方法與結(jié)果：1)濾紙片法2)菌落法3)試劑紙片法：制成干紙片，便于保存。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照菌株。★應(yīng)用：1)奈瑟菌屬陽(yáng)性、莫拉菌屬陽(yáng)性的鑒定2)腸桿菌科陰性、弧菌科、假單胞菌陽(yáng)性及其它非發(fā)酵菌的鑒別化酶活性★2.過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)(觸酶試驗(yàn))★注意事項(xiàng)①不宜用血平板上的菌落作試驗(yàn)，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性。②不宜用陳舊的培養(yǎng)物，以免出現(xiàn)假陰性③需設(shè)陰(鏈)、陽(yáng)(葡)鮮配制驗(yàn)(1)原理：某些細(xì)菌可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，后者在與乙酸作用生成亞硝酸，亞硝酸與對(duì)氨基苯磺酸作用，形成重氮苯磺酸，在與(3)結(jié)果：a加入試劑后顯紅色→陽(yáng)性b加入試劑后不顯紅色→加入鋅粉，顯紅色為陰性,不顯紅色為陽(yáng)性4.DNA酶試驗(yàn)★原理：細(xì)菌產(chǎn)生的DNA酶，可使長(zhǎng)鏈脫氧核糖核酸(DNA)水解成寡核苷酸。因?yàn)殚L(zhǎng)鏈DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸則溶于酸，所用玻片法檢測(cè)；另一種是分泌到菌體外的游離凝固酶，可用試管法檢測(cè)菌液呈均勻混濁狀態(tài)，為陽(yáng)性；菌液聚集呈團(tuán)塊或顆粒狀，為陰性mlml不凝固，則為陰性(24h后不凝固才報(bào)告陰性)。注意事項(xiàng)1)玻片法為篩選試驗(yàn)，陰、陽(yáng)性結(jié)果均需進(jìn)行試管法。2)血漿必需新鮮。3)應(yīng)使用EDTA抗凝血而非枸櫞酸鹽抗凝。有些凝固酶陰性的葡萄球菌和腸球菌可利用枸櫞酸鹽，使抗凝血再次凝固而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。4)最好不用人血。存在潛在的感染因子和凝固障礙6.CAMP試驗(yàn)(1)原理：B族鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進(jìn)葡萄球菌的β溶血素溶解紅細(xì)胞的活性，因此在兩菌(B族鏈球菌和葡萄球菌)的交(2)培養(yǎng)基：血瓊脂平板(3)應(yīng)用：B族鏈球菌陽(yáng)性，特異性鑒定(4)注意事項(xiàng)ATCCATCC它金葡結(jié)果不典型，甚至出現(xiàn)假陰性結(jié)果。(1)原理：膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，可能是膽汁降低了細(xì)菌細(xì)胞膜表面的張力使菌體裂解，也可能是膽汁加速了肺炎鏈球菌的自(2)培養(yǎng)基：10%去氧膽酸鈉或純牛膽汁(3)方法：平板法35℃30min(4)應(yīng)用：肺鏈+與甲鏈-的鑒別(五)抑菌試驗(yàn)★1.O/129敏感(抑菌)試驗(yàn)(1)原理：O/129對(duì)弧菌屬和鄰單胞菌屬有抑菌作用，而對(duì)氣單胞菌無(wú)此作用。(2)培養(yǎng)基：堿性瓊脂平板(3)方法：10ug/片、150ug/片(4)結(jié)果與應(yīng)用：屬間鑒定(1)原理：A群鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎全部敏感，而其他群鏈球菌絕大多數(shù)對(duì)其耐藥。(2)培養(yǎng)基：血瓊脂平板(1)原理：肺炎鏈球菌對(duì)奧普拖欣敏感，而其他鏈球菌對(duì)其耐藥。(2)培養(yǎng)基：血瓊脂平板(3)結(jié)果及應(yīng)用：用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別(六)其它試驗(yàn)A?！椒ㄅc結(jié)果：4%的KOH溶液保存期限不超過(guò)一周取一滴4%的氫氧化鉀水溶液(應(yīng)新鮮制)于潔凈的玻片上再取新鮮菌落少許，與氧化鉀溶液攪拌均勻，每隔幾秒上提接種環(huán)，觀察能否拉出絲來(lái)。能拉出粘絲為陽(yáng)性結(jié)果(革蘭陰性菌)，仍為菌懸液者陰性(革蘭s出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，革蘭陽(yáng)性菌60s以后仍為陰性反應(yīng)?！?.克氏雙糖鐵試驗(yàn)(復(fù)合生化反應(yīng))原理：克氏雙糖鐵(KIA)瓊脂用于觀察細(xì)菌對(duì)糖(葡萄糖和乳糖)的利用能力,以及是否產(chǎn)生硫化氫,可對(duì)細(xì)菌的種屬進(jìn)行初步鑒定?？耸想p糖鐵培養(yǎng)基制成高層(下層)和短的斜面(上層)其中乳糖濃度為葡萄糖濃度的10倍，。如果細(xì)菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，葡萄糖分解產(chǎn)生少量的酸，在最初培養(yǎng)的8~12h內(nèi)也足以使高層和斜面變黃(酚紅指示劑6.8~8.4，黃~紅)，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基斜面部分所產(chǎn)的酸因接觸空氣被氧化，并因細(xì)菌利用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，經(jīng)18~24h后整個(gè)斜面又恢復(fù)成紅色，深層在相，所產(chǎn)生的酸暫時(shí)不被氧化而仍呈黃色；如果細(xì)菌既分解葡糖糖，又分解乳糖，因培養(yǎng)基中含乳糖的濃度較高，產(chǎn)生大個(gè)培養(yǎng)基變黃；如果細(xì)菌分解培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生硫化氫，與培養(yǎng)基中的亞鐵離子生成硫化亞鐵黑色沉淀，使培養(yǎng)基7.抗原檢測(cè)：凝集反應(yīng)、免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)平或患者恢復(fù)期抗體效價(jià)比急性期升高≥4倍才有意義。9.細(xì)菌毒素檢測(cè)：內(nèi)毒素(革蘭陰性)→鱟試驗(yàn)；外毒素：體內(nèi)試驗(yàn)→動(dòng)物試驗(yàn)、體外試驗(yàn)→抗原抗體反應(yīng)菌的抗菌效果：一代頭孢菌素>二代>三代；對(duì)革蘭陰性球菌的抗菌效果：一代頭孢菌素<二代<三代2.抗菌藥物敏感試驗(yàn)(AST)的意義3.敏感(S):血藥濃度達(dá)到MIC4~8倍或以上。是指分離菌株能被測(cè)試藥物使用推薦劑量時(shí)，在感染部位通?？蛇_(dá)到的抗菌藥物濃度所抑耐藥(R)：MIC高于藥物在血液或組織中的濃度。是指分離菌株不能被測(cè)試藥物使用推薦劑量時(shí)在感染部位通?？蛇_(dá)到的抗菌藥物濃度物對(duì)分離菌株的臨床療效不可靠。4.中介(I):血藥濃度相當(dāng)于或略高于MIC。是指抗菌藥物MIC接近血液和組織中通?？蛇_(dá)到的濃度，療效低于敏感菌株，在藥物生理濃效力，或者可用高于正常劑量的藥物進(jìn)行治療；另外中介還作為緩沖區(qū)，以避免微小的不能控制的技術(shù)因素造成重大5.非敏感(NS):由于沒有耐藥菌株或耐藥菌罕見，此分類特指僅有敏感解釋標(biāo)準(zhǔn)的分離菌株。對(duì)于這些菌株應(yīng)當(dāng)確證鑒定結(jié)果和藥敏結(jié)驗(yàn)方法:1.紙片擴(kuò)散法(K-B法)2.稀釋法:(1)宏量肉湯稀釋法(2)微量肉湯稀釋法(3)瓊脂稀釋法Etest4.自動(dòng)化儀器法生長(zhǎng)的透明圈即抑菌圈，直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)折點(diǎn)，判定為敏感(S)、中介(I)或耐藥(R)2)細(xì)菌接種：涂抹法(15分鐘內(nèi)接種完畢),放置3~5分鐘。結(jié)果判讀,：量取抑菌圈直徑(結(jié)果判讀)1)菌懸液中嚴(yán)防菌塊存在。2)粘液型菌株、干燥型菌株可配成高濃度菌懸液，經(jīng)沉淀后取上清液稀釋至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝弧?)細(xì)菌接種后靜置3~5分鐘后再貼藥敏紙片。4)菌懸液調(diào)配好后15分鐘內(nèi)接種完畢。5)注意藥敏紙片之間的距離及紙片與培養(yǎng)基邊緣之間的距離6)藥敏紙片一旦貼上不得再移動(dòng)。7)常規(guī)工作中應(yīng)按要求進(jìn)行質(zhì)量控制。細(xì)菌獲得性耐藥可通過(guò)以下幾種機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)。改變：數(shù)量減少和/或構(gòu)型變化變，細(xì)菌突變?cè)斐煽椎鞍讈G失或降低其表達(dá)主動(dòng)外排機(jī)制S10.多重耐藥細(xì)菌(MDR)：細(xì)菌對(duì)常用抗菌藥物主要大類中的3類或以上耐藥。G藥。物。PBPa。選方法。判讀頭孢西丁對(duì)臨床分離的金黃色葡萄球菌和路鄧葡萄球菌抑菌環(huán)直徑≤21mm應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西林耐藥，≥22mm應(yīng)報(bào)告對(duì)苯唑西mm苯唑西林耐藥，≥25mm報(bào)告對(duì)苯酯類藥物的耐藥機(jī)制1、泵出機(jī)制(主動(dòng)外排)→MS型由msrA基因編碼紅霉素(R)克林霉素(S)B型鏈陽(yáng)霉素(R)m紅霉素(R)克林霉素(R)B型鏈陽(yáng)霉素(R)紅霉素(R)克林霉素(S)B型鏈陽(yáng)霉素(R)rmSrRNAMLSb結(jié)果：克林霉素抑菌環(huán)不出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，應(yīng)報(bào)告分離株對(duì)其敏感。鄰近紅霉素紙片側(cè)克林霉素抑菌環(huán)出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象(稱為“D”在可誘導(dǎo)的克林霉素耐藥，應(yīng)報(bào)告分離株對(duì)其耐藥，在報(bào)告中應(yīng)注明“通過(guò)誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)，推測(cè)此菌株對(duì)克林素對(duì)某些病人可能仍有效”。1.質(zhì)量保證(QA)：是指有計(jì)劃地、系統(tǒng)的評(píng)估和檢測(cè)患者診療質(zhì)量的整個(gè)過(guò)程，以便及時(shí)的發(fā)現(xiàn)問題，采取有效措施，提高服務(wù)質(zhì)量。位。3.臨床分類化膿性鏈球菌(A群)、馬鏈