GB∕T 19495.5-2018 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)方法

Quantitativereal-timepolymerasechain國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I——GB/T19495.1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)通用要求和定義；——GB/T19495.8轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)方法；本部分為GB/T19495的第5部分。1轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求GB/T19495.3轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法GB/T19495.7轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)抽樣和制樣方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)外源DNA插入受體作物基因組后經(jīng)重組產(chǎn)生的鄰接區(qū)序列。實(shí)時(shí)熒光PCRreal-timep2每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。定量下限limitofquantification;LOQ在準(zhǔn)確度和精確度處于可接受范圍內(nèi)時(shí)，樣品中可穩(wěn)定定量的分析物最低量或濃度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)referencematerial具有一種或多種足夠穩(wěn)定、均一和確定的特性值，用以對(duì)設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)、對(duì)測(cè)量方法進(jìn)行評(píng)價(jià)或?yàn)椴牧隙ㄖ档奈镔|(zhì)或材料?；w標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)matrixreferencematerial來(lái)源于植物原材料(如植物種子、葉子、根莖等),通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因品系及與其對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因品種材料通過(guò)一定質(zhì)量比進(jìn)行混合而制成的具有一定轉(zhuǎn)基因成分百分比含量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子plasmidreferencemolecule一種穩(wěn)定存在的重組質(zhì)粒分子，其包含了轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的目標(biāo)序列片段(如篩選基因片段、功能基因片段或品系特異性片段等),以及物種特異的內(nèi)標(biāo)推基因片段，可用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性定量檢測(cè)。3.2縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。ADH乙酯脫氫酶1基因(ateaholdehyarogenaso1)BHQ1黑洞醉滅基團(tuán)1①ikholeprencher4)Cf:采用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的轉(zhuǎn)換系數(shù)(copxersionfactor)DNA:脫氧核糖核酸(deaxyribonucleicacid)dATP:脫氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphatdGTP:脫氧鳥(niǎo)苷三磷酸(deoxgguanosinetriphosphate)dNTP:脫氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate)dUTP:脫氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)GS:谷氨酸合酶基因(glutaminesynthasegene)Lectin:植物凝集素基因MGBNFQ:小溝結(jié)合物無(wú)熒光猝滅基團(tuán)(minorgroovebindernonfluorescentquePCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)PLD:磷脂酶D家族基因(phospholipaseDfamilygene)ROX:一種熒光染料(carboxy-X-rhodmine)SAH7:類擬蘭芥屬同源序列7的棉花內(nèi)源基因(sinapisarabidopsishomolog7gene)3UGPase:馬鈴薯UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDP-glucosepyrophosphorylasegenefrom46檢測(cè)步驟6.1取樣和制樣按照GB/T19495.7中規(guī)定的方法執(zhí)行。6.2樣品DNA的提取與純化按照GB/T19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。每個(gè)樣品應(yīng)制備3個(gè)測(cè)試樣品提取DNA(提取平行重復(fù))。6.3DNA濃度測(cè)定和定量按照GB/T19495.3中規(guī)定的方法執(zhí)行。6.4實(shí)時(shí)熒光PCR豺增6.4.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系配制見(jiàn)表1.每個(gè)提取平行重復(fù)分別進(jìn)行至少3次內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和品系特異性序列的擴(kuò)增反應(yīng)(擴(kuò)增平行重復(fù))終濃度10×PCR緩沖液含量0m征下游引物反應(yīng)體系中各試劑的量可根據(jù)具體情況或不同的反應(yīng)總體積進(jìn)可選用含有PCR緩沖液、MgCl?、dNTP和Taq酶等成分的基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光PCR預(yù)混液進(jìn)行實(shí)bROX熒光試劑僅在具有ROX校正通道的實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)添加，否則用雙蒸水補(bǔ)足。6.4.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?qū)崟r(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為：50℃/2min;95℃/10min;95℃/15s,60℃/60s,40個(gè)循環(huán)。5制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)需設(shè)置至少5個(gè)濃度點(diǎn)，且設(shè)置的最低濃度點(diǎn)應(yīng)該盡量接近該擴(kuò)增目標(biāo)的定量下限。標(biāo)準(zhǔn)曲線上的每個(gè)濃度應(yīng)至少做3個(gè)平行重復(fù)。用5倍梯度對(duì)DNA模板進(jìn)行稀釋至4×10?拷貝、8000拷貝、1600拷貝、320拷貝和25拷貝，其中線。每個(gè)濃度模板DNA設(shè)置至少3個(gè)平行重復(fù)擴(kuò)增。擴(kuò)增后，根據(jù)擴(kuò)增Ct值與樣品濃度(拷貝數(shù))對(duì)數(shù)值間的線性關(guān)系制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線即以DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Ct值作為縱坐標(biāo)作梯度稀釋至10?拷貝、10?拷貝、10?拷貝、度，必須設(shè)置。采用稀釋后的DNA溶液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)濃度模板DNA設(shè)置至少3個(gè)平行重復(fù)擴(kuò)增。擴(kuò)增后，根據(jù)擴(kuò)增Ct值與樣品濃度(拷貝數(shù))對(duì)數(shù)值間的線性關(guān)系制備標(biāo)6.5.3.2Cf值測(cè)定背景差異。采用一定百分比含量的轉(zhuǎn)基因植物材料(包括基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))基因組DNA(濃度在102拷貝至10?拷貝之間)進(jìn)行Cf值的測(cè)定。即采用基因組DNA分別擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和品系特異性序列，擴(kuò)增反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)。然后根據(jù)上述基于質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出基因組DNA6CPeont——品系特異性序列拷貝數(shù)；CPref——內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù)；含量為100%。7結(jié)果分析與計(jì)算7.1質(zhì)量控制下述指標(biāo)有一項(xiàng)不符合者，需重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增：——空白對(duì)照：內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增Ct值≥40,品系特異性序列擴(kuò)增Ct值≥40;——陰性對(duì)照：內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增Ct值≤30,品系特異性序列擴(kuò)增Ct值≥40;——陽(yáng)性對(duì)照：內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因擴(kuò)增Ct值≤30,品系特異性序列擴(kuò)增Ct值≤35。被檢測(cè)的樣品核酸濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍內(nèi)，如不在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍內(nèi)，則需對(duì)樣品核酸濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整后重新進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增平行重復(fù)測(cè)試結(jié)果(轉(zhuǎn)基因品系百分含量)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≥25%,或提取平行重復(fù)的測(cè)試結(jié)果(轉(zhuǎn)基因品系百分含量)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≥35%,則應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，重新進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)應(yīng)從制備測(cè)試樣品開(kāi)始。標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)的計(jì)算如式(2)和式(3)所示X——測(cè)定值的平均值。7.2結(jié)果計(jì)算7.2.1樣品DNA濃度與拷貝數(shù)間的換算將樣品DNA濃度換算為DNA拷貝數(shù)可參照式(4)進(jìn)行計(jì)算：contpNA——DNA量，單位為納7.2.2樣品中目標(biāo)轉(zhuǎn)基因品系百分含量計(jì)算當(dāng)采用基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(包括基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，樣品中目標(biāo)轉(zhuǎn)基因品系百分含量按照式(5)進(jìn)行計(jì)算：7pctgt——目標(biāo)轉(zhuǎn)基因品系含量；CPemt——品系特異性序列拷貝數(shù)；CPre——內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù)。當(dāng)采用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，樣品中目標(biāo)轉(zhuǎn)基因品系百分含量按照式(6)進(jìn)行計(jì)算：CPrei——內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù)。7.2.3樣品轉(zhuǎn)基因成分含量計(jì)算每個(gè)提取平行重復(fù)的轉(zhuǎn)基因品系含量為3次擴(kuò)增平行重復(fù)計(jì)算出的轉(zhuǎn)基因成分含量的平均值。樣品的轉(zhuǎn)基因品系含量(%)為3個(gè)提取平行重復(fù)轉(zhuǎn)基因品系含量(%)的平均值。平均值的計(jì)算方法如式(7)所示。pctml=(pctpu+pctp?+pctpu?)/3…………(7)pctml——轉(zhuǎn)基因品系含量；pctmi——重復(fù)1轉(zhuǎn)基因含量；pctme——重復(fù)2轉(zhuǎn)基因含量；pctp——重復(fù)3轉(zhuǎn)基因含量。8結(jié)果表述8.1定量檢測(cè)結(jié)果表述定量檢測(cè)結(jié)果有3種可能，分別表述如表2所示。表2定量檢測(cè)結(jié)果表述檢出物種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，但未檢出目標(biāo)品系特異性序列未檢出轉(zhuǎn)基因××(植物名稱)××品系(品系名稱)檢出物種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和品系特異性序列，檢出轉(zhuǎn)基因××(植物名稱)××品系(品系名稱)含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍內(nèi)檢出轉(zhuǎn)基因××(植物名稱)××品系(品系名稱),8.2不確定度計(jì)算按照J(rèn)JF1059.1、SN/T4562的要求計(jì)算方法不確定度。8檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。各品系特異性序列的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增定量檢測(cè)限(LOQ)為0.1%(拷貝數(shù)百分比)。9實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物/探針序列和加入濃度見(jiàn)表A.1。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因或品系引物/序列(5'-3')小/bp正向內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因反向FAM-tccgagccgtecgtgcgtc正向反向FAM-tgttgtgctgccaatgtggcctg正向反向FAM-atctgccccagcactcgtccg正向反向FAM-cgcaccgattatttatactttagtccacct正向反向FAM-ccacctcccaacaataaaagcgcctg正向反向FAM-cgacaaaagatcaggatttggg正向反向FAM-cgtcaatttgtttacaccacaatatatcccg正向反向FAM-tcgatatgattccttcatcgagcgagc正向內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因反向FAM-attgtcctcttccaccgtgattccga內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因或品系引物/序列(5'-3')正向agtttgtaggttttgatgt內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因反向FAM-aaacataaaataatgggaacaaccatgacatgt正向反向FAM-ttgtccctccacttcttctc正向反向FAM-atcagattgtcgtttcccgccttcagtt正向反向FAM-ccgctctagaactagtggatctgcactgaa正向反向FAM-aactatcagtgtttgactacat-M正向反向FAM-cttaacagtactcggccgtcgaccgc正向反向FAM-ctccatggcgatcgctacgttctagaatt正向反向FAM-ttgggttaataaagtcagattagagggagacaa正向aaatattaacaatgcattg反向FAM-tactcattgctgatccatgtagatttcccg正向反向FAM-tcgcgcgcggtgtcatctatctc正向反向FAM-cctgcaggtcgacggccgagtac表A.1(續(xù))內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因或品系引物/序列(5'-3')小/bp正向反向FAM-ttcccggacatgaagccttaattcaat正向內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因反向FAM-cttaggggcagactcccgtgttccct正向反向FAM-ttaaactgaaggcgggaaacgacaa正向反向FAM-aaatacattcaaatatgtatccgctca正向反向FAM-agcaaccagatcggccgacacc正向反向acaaaagtgaactagttctFAM-ccgcgtaaactatcagtgtttagagaat正向反向FAM-cgtagctaaccttcattgtattccg正向反向FAM-ctctatcgatccccctcttgatagtttaaact正向反向正向反向FAM-cgagcggagtttatgggtcgacgg正向反向FAM-tctagacaattcagtacattaaaaacgtccgcca表A.1(續(xù))內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因或品系引物/序列(5'-3)小/bp正向反向FAM-aggcgggaaacgacaatctgatcatg正向反向FAM-aacatcctttgccattgcccagc正向反向FAM-tgaacacccatccgaacaagtagggtca正向反向正向反向FAM-teccgccttcagtttaaacagagtcgggt正向反向FAM-atccccggaaattatgtt-M正向反向aagagataacaggatccacFAM-tggtaccacgcgacacacttccactc正向反向FAM-teattgagtcgttccgccattgtcg正向反向FAM-taactcaaggccctcactccg正向反向FAM-actgctgacgcggccaaacactg正向反向FAM-cagtactcaaacactgatag-M表A.1(續(xù))物種內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因或品系引物/序列(5'-3')終濃度小/bp正向反向FAM-accacaatataccctcttccctgggcca正向反向正商Q內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因反向針FAM-agtccttatgtgctccactttctggtgc正向反向FAMigagoneggaetgesi正向0反向正向1反向正向反向FAM-ctcattgctgatccacctagccgact正向反向PAMectcatcatectcacccagtcagc正向反向FAM-caccggccaaattcgctcttagccg正向反向FAM-tagaggacctaacagaactcgccg正向gttcttctcttcatagctc反向FAM-ttagttagatcaggatattc表A.1(續(xù))內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因或品系引物/序列(5'-3')小/bp正向反向FAM-teccgcgtcateggcgg正向反向FAM-tagtcatcatgttgtaccacttcaacact正向反向FAM-agctgatggcaagttaatctccccgaagtcg正向內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因反向FAM-cttcaccttctatgcccctgacac正向ttcattcaaaataagatca反向正向反向FAM-cceggacatgaagccatttacaattgac正向反向FAM-cggtcctccgatcgcccttcc正向反向FAM-cggtcctccgatcgcccttcc正向反向FAM-tgacacaaatgatttcatacaaaagtcgaga正向反向FAM-ctctagagatccgtcaacatggtggagca