(高清版)GB∕T 18869-2019 飼料中大腸菌群的測定

代替GB/T18869—2002飼料中大腸菌群的測定國家市場監(jiān)督管理總局中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T18869—2019本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T18869—2002《飼料中大腸菌群的測定》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T18869—2002相比，主要技術(shù)內(nèi)容修改如下：——修改了適用范圍(見第1章，2002年版的第1章);--——增加了術(shù)語和定義(見第3章);———修改了原理的描述(見第4章，2002年版的第3章);——增加了LST發(fā)酵法(見8.3)。本標(biāo)準(zhǔn)由全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC76)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所[國家飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(北京)]。本標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：1GB/T18869—2019飼料中大腸菌群的測定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中大腸菌群的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料和飼料添加劑中大腸菌群的測定。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義3.1大腸菌群coliforms在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌?；诓此煞植嫉囊环N間接計數(shù)方法。4原理5培養(yǎng)基或材料5.6月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(lauryl2GB/T18869—20196.8pH計或精密pH試紙。樣品的采集應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。采樣過程應(yīng)遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來7.2.3獨(dú)立包裝大于500mL的液態(tài)產(chǎn)入同一個無菌采樣容器內(nèi)作為一件樣品。7.3.2應(yīng)在運(yùn)輸過程中保持樣品完整。8試驗方法本標(biāo)準(zhǔn)試驗方法分為乳糖膽鹽發(fā)酵法和LST發(fā)酵法，乳糖膽鹽發(fā)酵法適用于限量要求以MPN/100g(mL)為單位的產(chǎn)品，LST發(fā)酵法適用于限量要求以MPN/g(mL)為單位的產(chǎn)品。8.2.1.1固態(tài)和半固態(tài)樣品：稱取25g試樣，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)3GB/T18869—2019杯，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min,制成10倍稀釋的樣品勻液。8.2.1.2液態(tài)樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置于盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中，置于振蕩器中振蕩，充分混勻，制成10倍稀釋的樣品勻液。注：黏稠樣品宜采用固態(tài)稱量法。8.2.1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取10倍稀釋的樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管和吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換一只1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成100倍稀釋的樣品勻液。8.2.1.4根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換一只1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣液接種完畢，全過程不超過15min。每個樣品選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管乳糖膽鹽發(fā)酵管，每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管),置36℃±1℃培養(yǎng)按8.2.3和8.2.4程序進(jìn)行操作。將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別接種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)18h～24h,然后在上述平板上，挑取可疑菌落1個～2個進(jìn)行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24h±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告大腸菌群為陽性。乳糖膽鹽發(fā)酵法試驗程序圖見附錄B。8.3LST發(fā)酵法操作同8.2.1。每個樣品選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管LST肉湯，每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯),36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,觀察產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。8.3.3復(fù)發(fā)酵試驗(證實試驗)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于BGLB管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h,4GB/T18869—2019觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。LST發(fā)酵法試驗程序圖見附錄C。9.1根據(jù)確證為大腸菌群陽性的管數(shù)，檢索乳糖膽鹽發(fā)酵法大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表(見附錄D),報告每100g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。9.2根據(jù)確證為大腸菌群陽性的管數(shù)，檢索LST發(fā)酵法大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表(見附錄E),報告每克(毫升)[g(mL)]樣品中大腸菌群的MPN值。5GB/T18869—2019(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基或材料A.1乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基A.1.1成分蛋白胨豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)乳糖0.04%溴甲酚紫水溶液蒸餾水25mLA.1.2制法將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.2,加入指示劑，分裝每管10mL,并放入一個小導(dǎo)管，115℃高壓滅菌15min。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其余成分加倍。A.2伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)A.2.1成分蛋白胨乳糖磷酸氫二鉀瓊脂0.65%美藍(lán)溶液蒸餾水20mLA.2.2制備將蛋白胨、磷酸氫二鉀和瓊脂溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.1±0.2,分裝于燒瓶中，121℃高壓滅菌15min。臨用時加入乳糖并加熱溶解，冷至50℃~55℃,加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻，傾注平板。A.3乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基A.3.1成分蛋白胨乳糖0.04%溴甲酚紫水溶液蒸餾水25mL6GB/T18869—2019將蛋白胨及乳糖溶于水中，調(diào)節(jié)pH至7.4±0.1,按檢驗要求分裝30mL、10mL或3mL,并放入一個小導(dǎo)管，115℃高壓滅菌15min。3mL供證實試驗用。A.4革蘭氏染色法A.4.1.1成分結(jié)晶紫1g95%乙醇2g10g/L草酸銨溶液80mL將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.4.2革蘭氏碘液A.4.2.1成分碘化鉀2g蒸餾水300mLA.4.3沙黃復(fù)染液A.4.3.1成分沙黃0.25g95%乙醇2g蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。A.4.4.1將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染色1min,水洗。A.4.4.2滴加革蘭氏碘液，作用1min,水洗。A.4.4.3滴加95%乙醇脫色，約30s,或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色A.4.4.4水洗，滴加復(fù)染液，復(fù)染1min。水洗，待干，鏡檢。亦可用1:10稀釋石灰酸復(fù)紅染色液作復(fù)7GB/T18869—2019A.4.4.5結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色。革蘭氏陰性菌呈紅色。A.5月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯A.5.1成分胰蛋白胨或胰酪胨氯化鈉乳糖磷酸氫二鉀(K?HPO?)磷酸二氫鉀(KH?PO?)月桂基硫酸鈉蒸餾水2.75gA.5.2制備將上述成分溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。A.6煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯A.6.1成分蛋白胨乳糖牛膽粉(oxgall或oxbile)溶液0.1%煌綠水溶液蒸餾水200ggmLmLmLA.6.2制備將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL(將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5),用蒸餾水稀釋到975mL,調(diào)節(jié)pH至7.2±0.1,再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL,用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL,用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管A.7磷酸鹽緩沖液A.7.1成分磷酸二氫鉀(KH?PO?)蒸餾水500mLA.7.2制備儲備液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,用蒸餾水稀釋至1000mL后儲存于冰箱。8GB/T18869—2019稀釋液：取儲備液1.25mL,用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于錐形瓶(6.4)中，121℃高壓滅菌A.8無菌生理鹽水A.8.1成分氯化鈉8.5g蒸餾水1000mLA.8.2制備稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min。A.91mol/L氫氧化鈉溶液A.9.1成分氫氧化鈉(NaOH)40.0g蒸餾水1000mLA.9.2制備稱取40g氫氧化鈉溶于1000mL無菌蒸餾水中。A.101mol/L鹽酸溶液A.10.1成分蒸餾水1000mLA.10.2制法移取濃鹽酸90mL,用無菌蒸餾水稀釋至1000mL。9(規(guī)范性附錄)大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵法試驗程序圖大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵法試驗程序見圖B.1。產(chǎn)氣不產(chǎn)氣圖B.1大腸菌群乳糖膽鹽發(fā)酵法試驗程序(規(guī)范性附錄)大腸菌群LST發(fā)酵法試驗程序圖大腸菌群LST發(fā)酵法試驗程序見圖C.1。10倍系列稀釋36℃±1℃24h~-48h不產(chǎn)氣產(chǎn)氣BG1.B肉湯不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陰性大腸菌群陽性結(jié)果報告圖C.1大腸菌群LST發(fā)酵法試驗程序GB/T18869—2019(規(guī)范性附錄)乳糖膽鹽發(fā)酵法大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表每100g(mL)檢樣中大腸菌群最可能數(shù)(MPN)的檢索，見表D.1。表內(nèi)所列檢樣量如改用10g(mL)、1g(mL)和0.1g(mL)時，表內(nèi)數(shù)字相應(yīng)降低10倍；如改用0.1g(mL)、0.01g(mL)和表D.1乳糖膽鹽發(fā)酵法大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表陽性管數(shù)aMPN95%可信限上限下限00000l0020030100110120130200210220230300310320331001011021031101l1l2113120121—GB/T18869—2019表D.1(續(xù))陽性管數(shù)MPN95%可信限上限下限1221231301311321332002012022032l021l2221322022122222323023l232233300301302303303113123133