長春新堿發(fā)酵

長春新堿的發(fā)酵培養(yǎng)?？】≈参飳W(xué)專業(yè)學(xué)號MG1130001腫瘤是一類嚴重威脅人們生命和生活質(zhì)量的重大和主要疾病。據(jù)報道，每年中國有200萬人死于腫瘤，已經(jīng)占據(jù)病人人群1/4的份額，并且這個數(shù)據(jù)正在逐年攀升，惡性腫瘤已經(jīng)成為危害我國居民生命的各類疾病中的第一殺手。發(fā)達的歐美國家癌癥患者的數(shù)量更多，聯(lián)合國癌癥署日前指出，到2030年，全球癌癥死亡人數(shù)將達到每年1700萬人，超過目前的兩倍。長期以來,尋找抗癌生物資源與天然藥物成為各國醫(yī)藥、化學(xué)及生物學(xué)家的一個共同愿望。

長春花夾竹桃科長春花屬，為多年生草本，在中國主要在主要在長江以南地區(qū)栽培，花有多種顏色，花朵多，花期特長，從春到秋開花從不間斷，所以有“日日春”之美名。

其乳汁中所含生物堿，如長春花堿和長春新堿被提煉出來作為多種癌癥如白血病、哈杰金氏癥所用的化學(xué)治療藥物。純化的長春新堿中文商品名為維克思丁。全株具毒性需斟酌注意。誤食后，會造成白血球減少、血小板減少、肌肉無力、四肢麻痹等癥狀。長春新堿的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)長春新堿是一種雙吲哚型生物堿。分子式C46H58N4O9。存在于夾竹桃科植物長春花中。甲醇中重結(jié)晶時為針狀結(jié)晶。熔點211～216℃，比旋光度＋42°(氯仿)。溶于氯仿、丙酮和乙醇。其硫酸鹽熔點284～285℃，－28°(甲醇)；鹽酸鹽熔點244～246℃(分解)。長春新堿的抗癌機理抗腫瘤作用靶點是微管，主要抑制微管蛋白的聚合而影響紡錘體微管的形成。使有絲分裂停止于中期。還可干擾蛋白質(zhì)代謝及抑制RNA多聚酶的活力，并抑制細胞膜類脂質(zhì)的合成和氨基酸在細胞膜上的轉(zhuǎn)運。長春新堿的獲取辦法

五十年代末發(fā)現(xiàn)，長春堿和長春新堿具有抗腫瘤活性，尤其對白血病具有顯著療效。此后從長春花不同部位分離出100多種生物堿。但這些生物堿在植物體內(nèi)含量低，且植物生長緩慢，資源短缺，限制了抗癌藥物的進一步開發(fā)。人們轉(zhuǎn)而又進行植物組織培養(yǎng)研究，但植物組培成本高，生產(chǎn)難度大，有效成分含量低，也未能成功應(yīng)用于生產(chǎn)。長春新堿的發(fā)酵培養(yǎng)法一、原理由于植物真菌對植物某些藥效成分的形成有重要影響，甚至會產(chǎn)生和其寄主相同或相似的生理活性成分，而且真菌易于培養(yǎng)，可以通過育種手段條件等措施來大幅度提高其有效成分的含量，并便于組織工業(yè)化生產(chǎn)。故利用微生物生產(chǎn)抗癌成分前景十分廣闊

二、方法1）內(nèi)生菌的分離按常規(guī)無菌操作，取長春花不同部位的葉和莖干，按下列程序表面消毒，自來水沖洗→75%酒精漂洗（3~5分鐘）→無菌水沖洗3~4次→0.1%升汞沖洗（10~30s）→無菌水沖洗五次

將上述處理過的葉片和莖在超凈臺條件下切割成約0.5cm×0.5cm的小片（莖取韌皮部），然后將小片種植于PDA平板上，置28攝氏度溫箱培養(yǎng)3到7天后，即見樣品切割過的邊緣有菌絲生長出，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面上備用。為檢查表面消毒是否徹底，可做對照試驗，將上述同樣處理過的莖葉不做切割，直接種植于PDA平皿上，置于相同的條件下培養(yǎng)，結(jié)果對照的莖段周圍物任何菌長出，多次重復(fù)均如此，證明所分到的菌是韌皮部內(nèi)部的，不是表面的附生菌。圖1分離得到的內(nèi)生菌菌落75CG3圖2

75CG3菌株菌絲形態(tài)特征菌絲體纖細，白色，通常帶有紫色，該菌可產(chǎn)生兩種類型的分生孢子，大型分生孢子呈紡錘形至鐮刀形，多孢無色，小型分生孢子單孢無色卵形至橢圓形2)內(nèi)生菌的培養(yǎng)種子培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)基，將純化菌株接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)種子菌,3d后,取5mL

液體種子菌轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基：2.8L和10L小罐發(fā)酵方法：以3%接種量將種子培養(yǎng)液接入已滅菌(2.8L小罐進行實罐滅菌,10L罐先空消,再用無菌壓縮空氣吹干后加入滅過菌的培養(yǎng)基)、冷卻的發(fā)酵培養(yǎng)基中，100r/min，28℃通風培養(yǎng)16~18d，定期測定發(fā)酵液中長春新堿含量、生物量、總糖和pH值。3）長春新堿的鑒定可采用紫外