3.2.2基因工程的基本操作程序（PCR計算引物選擇）高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章基因工程基因工程的基本操作程序（PCR計算+引物選擇）P1.引物根據(jù)一段已知目的基因的核苷酸序列合成。2.PCR反應(yīng)體系的成分中能決定復(fù)制特定DNA片段的是（“模板”/“引物”）?3.PCR擴增時，DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個引物之間的DNA序列。4.延伸的方向是子鏈的5’→3’導(dǎo)思（一）引物選擇部分：8分鐘1.探針兩端分別連接一個熒光基團R和一個淬滅基團Q．2.機理:①探針結(jié)構(gòu)完整時,R發(fā)射的熒光被Q吸收；②而PCR擴增時,結(jié)合在模板鏈上的探針被切斷,使R和Q分離,R基團發(fā)射的熒光不被淬滅,這樣通過對熒光強弱的監(jiān)測可實現(xiàn)對產(chǎn)物的檢測。3.完成議的內(nèi)容議6分RT-PCR:(1)探針的水解，發(fā)生在PCR過程_延伸_階段。步驟③的目的是使_引物和探針_與目的基因通過形成_氫鍵（化學(xué)鍵）特異性結(jié)合。（2）PCR過程中，不斷消耗的是？原料、DNA聚合酶、模板、引物？

原料、引物

據(jù)此分析：“平臺期”出現(xiàn)的原因是試劑盒中原料、引物和探針數(shù)量一定，超出一定循環(huán)數(shù)后，熒光標(biāo)記的“雜交雙鏈”不再增加。（3）Ct值指“每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)”,當(dāng)樣本中初始模板越多,Ct值就(大\小)

小。(4)現(xiàn)有兩個待檢樣本,檢測時都出現(xiàn)了右圖曲線,但甲的a點比乙的a點明顯左移。合理的解釋是:_甲樣本中的新冠病毒含量更高達到閾值所需的循環(huán)數(shù)更少。展8【拓】“熒光RT—PCR技術(shù)”試劑盒應(yīng)該含:_模板×_逆轉(zhuǎn)錄酶__、_耐高溫的DNA聚合酶_、熒光標(biāo)記的核酸探針、引物、dNTP、緩沖液。拓應(yīng)用:1.RT-PCR對基因表達[轉(zhuǎn)錄+翻譯]的檢測僅限于轉(zhuǎn)錄_水平，根據(jù)PCR產(chǎn)物的濃度又可以估算_起始模板RNA_的濃度，以此代表目的基因在特定組織中的表達量。

2.還可對某些微量RNA病毒的檢測，可提高檢測的靈敏度，原因是增加了待測RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的DNA的數(shù)量，便于檢測_。

展8議1.如果擴增序列為下圖所示的兩段序列之間的DNA片段，合適的引物是_甲和D__。5′→GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG-3′3′-CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC-5′引物Ⅰ引物Ⅱ甲5′-GACCTGTGGAAGCA5′-CATACGGGATTG乙5′-CTGGACACCTTCGB5′-GTATGCCCTAAC丙5′-CGAAGGTGTCCAGC5′-GTTAGGGCTTAC丁5′-GCTTCCACAGGTCD5′-CAATCCCGTATGT1（1）圖1選取___BE__作為引物。展評9T1（2）圖2選取___1,4_為引物。T2利用PCR擴增T-DNA片段，選擇引物是AD

PCR擴增被插入的基因片段，選擇引物是BC拓：①利用PCR擴增已知序列T-DNA：選用引物

②③②對兩側(cè)未知序列進行測序：做法是：用

DNA連接酶連接成環(huán)狀后，再用引物①④

PCR擴增后測序展評93.引物設(shè)計要求：①PCR中引物不能過長的原因__防止引物自身堿基互補配對造成自身環(huán)化___________②引物不能過短原因__引物與模板鏈結(jié)合的特異性差,容易擴增出非目的基因片段③每一種引物的內(nèi)部以及兩種引物之間不能發(fā)生過多的堿基互補配對，據(jù)圖4分析，下列兩組引物設(shè)計都不合理的原因：第一組引物:引物I和引物II局部發(fā)生堿基互補配對_第二組引物:引物I’自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效_。____________

T4.若已知一段目的基因的一個引物，能否據(jù)此寫出另一個引物，說明原因？不能兩種引物序列無相關(guān)性展評91.引物數(shù)=新形成的DNA分子鏈數(shù)

一個DNA擴增n次，引物數(shù)=2n×2-2=2n+1-22.數(shù)量：引物1=引物23.等長DNA片段=目的基因片段導(dǎo)4思（二）PCR計算部分

6分鐘T5.結(jié)合圖5（1）填寫右表(2)至少循環(huán)

3

次才會出現(xiàn)等長的DNA片段,即

⑤

。經(jīng)n輪循環(huán)后,①②各

1

個,③④各n-1個,⑤(目的基因)共有2n-2n

個。T6.擴增n輪后,含有引物1的DNA分子

有

2n-1

個,

只含引物1的DNA分子有

1

個，同時含引物1和引物2DNA分子有2n-2個。T7.已知引物數(shù)=新合成的子鏈數(shù):(1)一個目的基因擴增n代,需消耗2（2n-1）

個引物,需要

2n-1

個引物1。①②③④①②③④⑤展評411.PCR循環(huán)n次，等長的目的基因數(shù)量是2n-2n。循環(huán)5次，目的基因有？25-2×5含有引物1和引物2的DNA有幾個？25-2消耗引物多少個？（25-1）×22.新冠病毒是一種RNA病毒，檢測新冠病毒RNA可采取RT-PCR法。這種方法需要的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶耐高溫的DNA聚合酶。3.提取新冠病毒的RNA，通過_逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。過程Ⅰ和過程Ⅱ利用的原料相同（填“相同”“不同”或“不完全相同”）4.右圖擬對m個單鏈cDNA進行n次循環(huán)的擴增，理論上至少需要__m×2n-1____個引物B。檢5.退火溫度過高會破壞引物與模板DNA鏈的堿基配對。長度相同但G、C堿基所占比率較高的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。6.引物A和B的長度越長、G和C比例越高，則PCR循環(huán)步驟中的復(fù)性（填“變性”“復(fù)性”或“延伸”）溫度設(shè)定就越高。7.PCR中引物不能過長的原因__防止引物自身堿基互補配對造成自身環(huán)化___________②引物不能過短原因__引物特異性差,容易擴增出非目的基因片段2.判斷：①判斷：限制酶是一種酶錯

一類酶②質(zhì)粒只有在侵入宿主細(xì)胞后，才能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制錯

P74質(zhì)粒能自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。③DNA連接酶對所連接的DNA兩端的堿基序列有專一性要求錯④限制酶能夠識別新冠病毒特定的核苷酸序列并在特定位點切開磷酸二酯鍵錯

不識別RNA⑤EcoRI識別序列和切割位點為G↓AATTC，則形成的黏性末端為AATTC-錯

AATT⑥用F和G酶切割目的基因和質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒，則應(yīng)該用四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含重組質(zhì)粒的受體菌。錯

不能直接就是四環(huán)素

應(yīng)該是氨芐青霉素⑦限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的識別序列如下：—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。圖示某一目的基因片段與質(zhì)粒拼接形成重組質(zhì)粒的過程。將重組質(zhì)粒同時用以上2種限制酶切割則會再形成1種長度的DNA片段

對

重組之后不能被這兩種酶識別⑧若DNA上的堿基隨機排列，NotI限制酶切割位點出現(xiàn)頻率低于其他三種限制酶對

⑨某環(huán)狀DNA分子，用BamHⅠ完全切割該DNA分子后產(chǎn)生2個片段