藥學畢業(yè)答辯課件-HPLC-MSMS法測定人血漿中伏立康唑的濃度

HPLC-MS/MS法測定人血漿中伏立康唑的濃度指導教師：班級：學生：學號：目錄背景和意義儀器和試劑研究方法結(jié)果結(jié)論致謝背景和意義背景

有關(guān)伏立康唑的測定方法,國內(nèi)外已有很多報道,常用HPLC法。但HPLC法通常需要10min以上的分析時間，選擇性不強，應用于臨床患者血樣分析時通常易受干擾。液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）具有根據(jù)物質(zhì)的質(zhì)荷比進行定量，靈敏度高且干擾小，是生物樣本分析的首選方法。

背景和意義意義伏立康唑是一種新型的三唑類抗真菌藥,臨床使用存在個體差異大、不良反應多、易發(fā)生藥物相互作用、人體內(nèi)代謝呈非線性藥代動力學特征等問題。建立一種新型快速的測定伏立康唑血藥濃度的方法有助于臨床藥師為患者提供更好的藥學服務。儀器和試劑

儀器：API5500Q高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；電子天平；移液槍（200L、1000L）；渦旋混合器；純水儀等。

試劑：伏立康唑標準品（純度：100%），購于中國藥品生物檢定所；格列吡嗪（內(nèi)標），購于中國藥品生物檢定所。甲醇、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純，空白血漿為北京大學人民醫(yī)院提供。研究方法

以格列吡嗪為內(nèi)標，血漿樣品經(jīng)與甲醇和內(nèi)標物混合離心提取分離，以甲醇-0.2%甲酸水溶液（60:40，v/v）為流動相，以液相色譜分離、電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜進行檢測，測定伏立康唑（m/z350.3→127.1）的濃度。研究結(jié)果1.特異性試驗2.標準曲線和定量下限3.精密度和準確度4.回收率和基質(zhì)效應5.穩(wěn)定性1.特異性試驗結(jié)果圖1空白血漿色譜圖圖2空白血漿加內(nèi)標色譜圖圖3伏立康唑LLOQ（10ng·ml-1）色譜圖圖4伏立康唑QCL（30ng·ml-1）色譜圖1.特異性試驗結(jié)果圖5伏立康唑QCM（800ng·ml-1）色譜圖圖6伏立康唑QCH（2400ng·ml-1）色譜圖

從圖1到圖6，我們可以發(fā)現(xiàn)伏立康唑、內(nèi)標溶液、六個不同來源的空白血漿、以及伏立康唑+六個不同來源的空白血漿（最低定量限點）進樣后內(nèi)標和伏立康唑峰與雜峰分離完全，峰形對稱，同時最低定量限樣的信噪比，其信號大小與其自身空白血漿樣在相同保留時間處的噪音相比在5以上。2.標準曲線和定量下限表：伏立康唑的標準曲線線性方程相關(guān)系數(shù)（r）y=0.00266x+0.01060.9985y=0.00274x+0.005380.9990y=0.00263x+0.0060.9991

y=0.00248x+0.03760.9991

測得線性范圍內(nèi)伏立康唑的回歸系數(shù)均在0.998以上，自身濃度計算值與其理論值的偏差均在15%以內(nèi)。2.標準曲線和定量下限表：伏立康唑LLOQ日內(nèi)測定時的測得值和準確度序號測得值(ng·ml-1)(%)120.90104219.9099.5320.60103420.10101520.50103619.6097.9mean20.27101.40SD0.482.36%CV2.392.33

在最低定量限濃度時，信噪比可以達到5倍以上，平均準確度為101.4%，精密度為2.39%。因此本試驗確定的伏立康唑的最低定量限為20ng·ml-1。3.精密度和準確度

批內(nèi)精密度和準確度：在一日內(nèi)對一批質(zhì)控樣品按照樣品處理方法進行處理，測定后用同日隨行的標準曲線進行濃度計算，結(jié)果顯示，伏立康唑的所有測試樣品精密度(2.19%)，準確度(95.1%-103.5%)均在要求的范圍內(nèi)。

批間精密度和準確度：在三天的時間內(nèi)所測得的質(zhì)控樣品，其變異系數(shù)在3.6%以內(nèi)，準確度的結(jié)果符合要求。4.回收率和基質(zhì)效應回收率：本樣品處理方法，伏立康唑低濃度質(zhì)控、中濃度質(zhì)控、高濃度質(zhì)控質(zhì)控樣品的提取回收率分別為102.0%、101.9%、100.8%，變異系數(shù)分別為2.59%，0.70%和3.20%；內(nèi)標樣的提取回收率為99.4%，變異系數(shù)為3.92%。

基質(zhì)效應：本樣品處理方法，伏立康唑低濃度質(zhì)控、中濃度度質(zhì)控、高濃度質(zhì)控樣品的基質(zhì)效應分別為95.6%、100.7%、98.6%，變異系數(shù)分別為6.57%、0.98%和2.99%。5.穩(wěn)定性

樣品室溫放置穩(wěn)定性：伏立康唑的含藥漿在室溫放置6h后，QCL、QCM、QCH三個質(zhì)控濃度與理論值的偏差均和變異系數(shù)在允許的范圍內(nèi)，說明樣品在室溫放置6h時仍然穩(wěn)定。

樣品處理后2-8℃放置穩(wěn)定性：伏立康唑處理后樣品2-8C放置24h后，QCL、QCM、QCH三個質(zhì)控濃度與標定值的偏差和變異系數(shù)均在允許的范圍內(nèi)，說明樣品后于28C放置24h仍然穩(wěn)定。5.穩(wěn)定性

基質(zhì)中藥物-80℃長期穩(wěn)定性：伏立康唑在人血漿中-80C放置12天（20140802-20140814）穩(wěn)定。

儲備液2-8℃保存穩(wěn)定性：伏立康唑儲備液28℃保存12天（20140802-20140814）是穩(wěn)定的。結(jié)論

本試驗從實際需要出發(fā)，建立了一個快速、特異、穩(wěn)定的LC-MS/MS方法，通過采用APCI源的離子化方式，降低了復雜樣本基質(zhì)的干擾，使得分析速度比現(xiàn)有文獻報道的方法提高了3倍以上，極大地縮短了分析時間，能及時地為臨床醫(yī)師和臨床藥師提供相應的信息，以優(yōu)化臨床給藥劑量，提高伏立康唑應用的安全性和有效性。致謝大學本科的學習生活即將結(jié)束。在