AbMole基于高容量腺病毒載體和 CRISPR-Cas9 核酸酶的大規(guī)模基因組編輯

AbMole|基于高容量腺病毒載體和CRISPR-Cas9核酸酶的大規(guī)?；蚪M編輯在醫(yī)學(xué)科研的征程中，每一次重大的發(fā)現(xiàn)都如同照亮黑暗的明燈，為那些被疾病困擾的人們帶來(lái)希望的曙光。一篇發(fā)表在《NucleicAcidsResearch》的研究論文引起了廣泛關(guān)注，這篇論文展示了一種基于高容量腺病毒載體（AdVPs）和CRISPR-Cas9核酸酶的大規(guī)?；蚪M編輯技術(shù)，為杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）的治療帶來(lái)了新的突破。來(lái)自萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞與化學(xué)生物學(xué)系的FrancescaTasca,MarcellaBrescia,QianWang等多名研究人員發(fā)表了題為《Large-scalegenomeeditingbasedonhigh-capacityadenovectorsandCRISPR-Cas9nucleasesrescuesfull-lengthdystrophinsynthesisinDMDmusclecells》的研究成果。在該文章中，研究人員使用了購(gòu)自AbMole的IWP-L6（目錄號(hào)M2781）。杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良是一種由DMD基因突變引起的致死性、頻繁的X連鎖肌肉萎縮疾病。這種疾病給患者及其家庭帶來(lái)了巨大的痛苦和負(fù)擔(dān)。目前，大多數(shù)DMD定向基因療法是突變特異性的，且只能產(chǎn)生部分功能的微抗肌萎縮蛋白或縮短的Becker樣抗肌萎縮蛋白。然而，通過(guò)穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白來(lái)補(bǔ)充DMD致病突變有望提供更有效、更廣泛適用的治療方法。在這項(xiàng)研究中，研究者們利用高容量腺病毒載體和CRISPR-Cas9核酸酶進(jìn)行大規(guī)?；蚪M編輯。高容量腺病毒載體具有無(wú)病毒基因、包裝容量大、遺傳穩(wěn)定性高、易于修改細(xì)胞嗜性以及能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非分裂細(xì)胞等特點(diǎn)。這些特性使得AdVPs成為將較大的基因載荷插入難轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞和祖細(xì)胞中的理想載體。圖1.AdVP的表征和測(cè)試，用于優(yōu)化AAVS1靶向RGN復(fù)合物的一體化遞送。CRISPR-Cas9核酸酶是一種強(qiáng)大的基因組編輯工具，它可以在特定的位點(diǎn)切割DNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的精確編輯。在這項(xiàng)研究中，研究者們利用CRISPR-Cas9核酸酶在DMD肌細(xì)胞中產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，然后將攜帶全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白基因的AdVPs導(dǎo)入細(xì)胞中。通過(guò)同源重組，全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白基因被插入到內(nèi)源位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)DMD肌細(xì)胞的基因修復(fù)。圖4.挽救AdVP校正的DMD肌肉細(xì)胞中的全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白合成。為了驗(yàn)證這種方法的有效性，研究者們進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。首先，他們?cè)谌藢m頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞、人野生型成肌細(xì)胞、DMD缺陷型成肌細(xì)胞、DMD缺陷型iPSCs、野生型iPSCs以及PEC3.30AdVP包裝細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)。然后，他們構(gòu)建了用于產(chǎn)生纖維修飾的AdVPs的分子克隆，包括編碼與EGFP融合的人全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白的構(gòu)建體（EGFP::DYS）和含有合成的436-bp橫紋肌特異性CK8啟動(dòng)子的構(gòu)建體等，并對(duì)產(chǎn)生的AdVPs進(jìn)行了純化和表征。接下來(lái)，研究者們利用慢病毒載體將CRISPR-Cas9核酸酶導(dǎo)入DMD缺陷型成肌細(xì)胞中，在細(xì)胞中產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。然后，他們將攜帶全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白基因的AdVPs導(dǎo)入細(xì)胞中，通過(guò)同源重組，全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白基因被插入到內(nèi)源位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種方法可以有效地修復(fù)DMD肌細(xì)胞中的致病突變，恢復(fù)全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白的合成。此外，研究者們還對(duì)這種方法的安全性進(jìn)行了評(píng)估。他們發(fā)現(xiàn)，AdVPs和CRISPR-Cas9核酸酶在細(xì)胞中的表達(dá)水平較低，不會(huì)引起明顯的細(xì)胞毒性和免疫反應(yīng)。這表明，這種方法具有較高的安全性，有望在臨床治療中得到應(yīng)用。這項(xiàng)研究為杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的治療帶來(lái)了新的希望。通過(guò)基于高容量腺病毒載體和CRISPR-Cas9核酸酶的大規(guī)模基因組編輯技術(shù)，研究者們成功地修復(fù)了DMD肌細(xì)胞中的致病突變，恢復(fù)了全長(zhǎng)抗肌萎縮蛋白的合成。這種方法具有高效、安全、廣泛適用等優(yōu)點(diǎn)，有望成為未來(lái)DMD治療的重要手段。然而，這項(xiàng)研究也存在一些不足之處。例如，目前這種方法還處于實(shí)驗(yàn)室階段，需要進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，以驗(yàn)證其安全性和有效性。此外，這種方法的成本較高，需要進(jìn)一步降低成本，以便在臨床治療中得到廣泛應(yīng)用?？傊@項(xiàng)研究為杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的治療帶來(lái)了