綿羊腹腔鏡活體采卵技術(shù)規(guī)程

1綿羊腹腔鏡活體采卵技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了綿羊腹腔鏡采卵中術(shù)語和定義、供體綿羊選擇、抽卵液配制及采卵操作的內(nèi)容。本文件適用于綿羊腹腔鏡活體采卵。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T1571羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1活體采卵OvumPick-Up借助活體采卵儀或其他一些裝置來完成活體狀態(tài)下采集卵母細(xì)胞一系列過程。3.2供體Donor提供卵母細(xì)胞的個體。4供體綿羊的選擇選擇品種優(yōu)良，符合品種外貌特征、譜系清楚的一級以上的羊（母羊），以1.5～6周歲為宜；產(chǎn)后空懷90d以上，至少有兩次以上正常發(fā)情周期；體質(zhì)健壯，繁殖機(jī)能正常，無遺傳疾病、生殖系統(tǒng)疾病和傳染性疫病。5抽卵液配制DPBS+10%（v:v）FBS+1mg/mLBSA+6IU/mL肝素鈉+1.0%青鏈霉素合劑，混勻后用Millipore0.22μm的過濾器過濾，在0℃~5℃條件下可保存2周。6采卵操作26.1采卵前準(zhǔn)備6.1.1供體羊準(zhǔn)備為了便于觀察卵巢并防止麻醉期間的并發(fā)癥，按手術(shù)批次將羊群趕到空腹羊圈：冬季控水控料36h、夏季控水24h控料36h、哺乳期羔羊手術(shù)前12小時空腹。6.1.2手術(shù)室準(zhǔn)備術(shù)前一天打掃手術(shù)室并用紫外線消毒60min；術(shù)前用新潔爾滅水將創(chuàng)布浸泡10min并甩干水分；術(shù)前30min用酒精消毒工作臺。6.1.3器械消毒和擺放器械消毒：提前30min用75°酒精噴灑長臂鉗、套管、穿刺針和腹腔鏡鏡頭；酒精噴灑完5min后放入器械杯。儀器合理擺放：無菌操作臺鋪好無菌布；將擺放儀器杯倒入3/4的清水，水中倒入適量的碘酊；將兩把長臂鉗、三個套管、三個穿刺針和鏡頭合理擺放在儀器杯內(nèi)；準(zhǔn)備無菌刀片，如果穿刺比較困難，用刀片將穿刺部位用刀片點破，負(fù)壓機(jī)擺放一旁待用。6.2穿刺操作6.2.1麻醉與保定根據(jù)“NY/T1571羊胚胎移植技術(shù)規(guī)程”進(jìn)行手術(shù)準(zhǔn)備，即用2mg/KBW氯胺酮、0.10mg/KBW地西泮和0.05mg/KBW賽拉嗪組成的混合物進(jìn)行麻醉，以便插管。穿刺手術(shù)前將動物固定在保定架上，將腹側(cè)手術(shù)區(qū)域的毛剃光。保定架呈一定傾斜度，頭部處于低位，以利操作，并用2%洗必泰和1%碘液進(jìn)行消毒，用干凈的創(chuàng)布遮蓋在手術(shù)部位靠下方的位置，且用創(chuàng)巾鉗固定。6.2.2腹部穿孔穿刺前選擇三個穿刺孔，穿孔時將腹部外皮向上提起，穿刺針抵住手術(shù)位置，向腹腔內(nèi)空洞方向刺入；第一個腹腔鏡套管穿刺針在母羊左側(cè)乳房基部下方2～5cm處的位置刺入最佳(靠近腹中線）；第二個穿刺孔位于腹中線兩側(cè)，離乳房10～15cm；第三個穿刺孔位于右側(cè)乳房基部3～6cm處。三個孔刺入時注意皮和腹膜的穿刺點位置不要錯開，注意避開血管。6.2.3設(shè)備放置將長臂鉗放入指定的穿刺孔內(nèi)，用腹腔內(nèi)窺鏡觀察穿刺套管是否進(jìn)入腹腔內(nèi)，如果腹部脂肪過大，導(dǎo)致視野內(nèi)未看見套管，可用長臂鉗或穿刺針撥開油脂使套管暴露在視野內(nèi)。穿刺的中間孔放進(jìn)長臂鉗用于輔助右側(cè)的長臂鉗將卵巢固定好，固定時盡量避免不必要的損傷。右側(cè)長臂鉗將卵巢固定好，中間長臂鉗拔出，將采卵針放進(jìn)套管，準(zhǔn)備采卵。6.3抽卵操作6.3.1準(zhǔn)備工作采卵前將采卵針和吸管用抽卵液沖洗一遍，試管內(nèi)采卵液不少于2mL抽卵液，要記錄抽取卵泡的數(shù)量，要從下往上抽取，預(yù)防出血遮擋未抽取的卵泡6.3.2卵泡穿刺3觀察卵巢后，用卵巢固定鉗夾住卵巢的系帶部分已固定卵巢，通過采卵針在內(nèi)窺鏡的觀察下依次抽吸2mm以上的有腔卵泡；抽取大卵泡或抽取的卵泡液多時，要輕輕的晃動采卵液，以防止試管內(nèi)的液體粘連；采卵管內(nèi)抽到血時要及時進(jìn)行清洗，防止在管內(nèi)凝結(jié)容易粘住卵，降低回收率；采卵完成后迅速將采卵試管送回實驗室內(nèi)進(jìn)行檢卵與體外培養(yǎng)。6.3.3術(shù)后流程手術(shù)完