肺動(dòng)脈高壓基因診治的研究進(jìn)展

肺動(dòng)脈高壓基因診治的研究進(jìn)展肺動(dòng)脈高壓是一種以肺動(dòng)脈壓力增高、肺血管重構(gòu)為主要病理改變的進(jìn)展性疾病，其病因尚未完全闡明，治療上缺乏有效的根治手段，預(yù)后不良。近年來，隨著細(xì)胞及分子學(xué)研究的開展，基因技術(shù)被應(yīng)用于肺動(dòng)脈高壓的診治?；蚣夹g(shù)從分子生物學(xué)水平探索肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，目前已取得一系列進(jìn)展，有望開辟肺動(dòng)脈高壓診治的新領(lǐng)域?，F(xiàn)就基因技術(shù)在肺動(dòng)脈高壓的診治方面的研究進(jìn)展做一綜述。標(biāo)簽：肺動(dòng)脈高壓；基因診斷；基因治療肺血管疾?。≒ulmonaryvasculardisease，PVD）是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療涉及多個(gè)學(xué)科，病死率高，預(yù)后差。肺動(dòng)脈高壓（Pulmonaryarteryhypertension，PAH）是最常見的一種肺血管疾病，以肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性增高、肺血管重構(gòu)為主要病理改變，臨床可表現(xiàn)為呼吸困難、乏力、活動(dòng)耐量減低、暈厥、心絞痛等，嚴(yán)重者可發(fā)展為右心功能衰竭而死亡。由于肺動(dòng)脈高壓的病因及發(fā)病機(jī)制仍未確切，基因診療技術(shù)尚處于基礎(chǔ)研究和臨床動(dòng)物試驗(yàn)階段。1基因診斷基因診斷技術(shù)通過探究疾病的致病基因，不僅能對(duì)遺傳疾病做出確切的診斷、指導(dǎo)治療和評(píng)估預(yù)后，還能為其他家族成員提供有效的患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，制定科學(xué)的隨訪策略，進(jìn)行合理的早期干預(yù)[1]。目前被證實(shí)與PAH的發(fā)病有關(guān)聯(lián)的突變基因有骨形成蛋白II型受體基因（BMPR2gene），激活素受體樣激酶1基因（ACVRL1/ALK1），內(nèi)皮糖蛋白基因（Endoglin），微小核糖核酸（miRNAs）。1.1骨形成蛋白II型受體（BMPR2）骨形成蛋白Ⅱ型受體（BMPR2）基因是特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（FPAH）和家族性肺動(dòng)脈高壓（IPAH）的重要致病基因。BMPR2屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）受體超家族成員，當(dāng)配體TGF-β與之結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生的效應(yīng)使下游一類重要的轉(zhuǎn)錄因子smads蛋白發(fā)生磷酸化，繼而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞的生理活動(dòng)。最近的研究報(bào)道了BMPR2基因啟動(dòng)子突變與PAH的發(fā)病存在密切關(guān)系，尤其是FPAH和IPAH[2]，提示BMPR2基因突變的篩查可能成為PAH易感人群早期診斷和干預(yù)的有效手段。1.2內(nèi)皮糖蛋白（Endoglin）內(nèi)皮糖蛋白是TGF-β信號(hào)的輔助跨膜受體，主要表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的輔助因子。Endoglin可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)TGF-β的反應(yīng)，參與血管發(fā)育和重塑，維持ALK1和ALK5的表達(dá)平衡。Gore等[3]提取15例特發(fā)性PAH患者和15例健康者的肺平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)特發(fā)性PAH患者的內(nèi)皮細(xì)胞中存在Endoglin的高效表達(dá)，這可能與Endoglin對(duì)肺動(dòng)脈高壓的反饋性調(diào)控有關(guān)。Gore推測(cè)TGF-β/Endoglin信號(hào)通路可能通過調(diào)控肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子和炎性介質(zhì)參與PAH的病理過程，在特發(fā)性PAH和低氧型PAH的發(fā)病中起著重要作用。Endoglin基因篩查可作為特發(fā)性PAH和低氧型PAH的診斷手段之一。1.3微小核糖核酸（miRNAs）miRNAs是一類微小的非編碼RNA，通過連接特定序列和靶mRNA調(diào)控基因表達(dá)，單個(gè)miRNA具有調(diào)控多個(gè)作用靶點(diǎn)的功能，而單個(gè)基因或靶點(diǎn)可受到多個(gè)miRNA調(diào)控。有研究提出，miRNAs能調(diào)控PAH患者的基因表達(dá)，但具體調(diào)控機(jī)制尚未明確。Caruso[4]構(gòu)建了PAH小鼠的慢性缺氧模型，基因篩查發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織內(nèi)的dicer酶和miR-22、miR-30表達(dá)下調(diào)。用同樣的方法對(duì)PAH小鼠的野百合堿模型進(jìn)行檢測(cè)，得到了相同的結(jié)論。2基因治療基因治療是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正基因異常和缺陷引起的疾病。相比于傳統(tǒng)的藥物、化學(xué)和放射治療，其著重于探究疾病的發(fā)病機(jī)制、病理生理過程，主張病因治療。2.1一氧化氮合酶（NOS）NO是一種自分泌和旁分泌的信號(hào)分子，參與調(diào)控平滑肌松弛、血小板抑制、神經(jīng)傳遞、腫瘤細(xì)胞溶解、刺激荷爾蒙釋放等多個(gè)生理過程。一氧化氮合酶（NOS）負(fù)責(zé)NO的合成，目前已經(jīng)證實(shí)的NOS分為三類：NOS1，NOS2，NOS3，不同類型的NOS的表達(dá)和調(diào)控功能各異。Zhao[5]設(shè)立NOS3基因敲除的小鼠為研究對(duì)象，通過測(cè)定肺動(dòng)脈壓、左室舒張末壓、胸主動(dòng)脈血流參數(shù)對(duì)比基因敲除前后的肺血流動(dòng)力學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NOS3基因缺陷可導(dǎo)致蛋白激酶G酪氨酸化及活性損傷，誘發(fā)肺動(dòng)脈高壓。2.2血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂與增殖，誘導(dǎo)血管生成的功能，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合、腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移過程中亦發(fā)揮重要作用。Farkas[6]研究了先天性纖維化（IPF）鼠并發(fā)PAH的發(fā)病機(jī)理，測(cè)得小鼠體內(nèi)VEGFmRNA和其受體表達(dá)下調(diào)，組織學(xué)顯示微脈管系統(tǒng)缺失和肺血管重塑。表明VEGFmRNA表達(dá)異?？赡軙?huì)加重肺血管重塑，損害心肌灌注。故VEGF基因療法應(yīng)用于PAH的臨床治療前還需評(píng)估安全性問題。2.3前列環(huán)素合酶（PGIS）前列環(huán)素合酶（PGIS）是環(huán)前列素（PGI2）合成代謝途徑的終末酶。PGI2是一種高效的內(nèi)皮源性血管舒張因子，具有抑制血小板粘附和擴(kuò)張血管的作用，可用于動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、肺動(dòng)脈高壓的治療。重度PAH患者肺毛細(xì)血管存在PGIS缺陷，但這種缺陷導(dǎo)致肺血管重塑的機(jī)制尚不確切。以間充質(zhì)干細(xì)胞為載體，轉(zhuǎn)染PGIScDNA的MCT-PAH鼠體內(nèi)存在高效表達(dá)的PGIS。構(gòu)建經(jīng)氣道PGIS基因（cDNA）轉(zhuǎn)染和cDNA基因缺陷的MCT-PAH鼠模型，測(cè)得前者平均肺動(dòng)脈壓和肺血管總阻力均明顯低于后者（P＜0.01），二者全身性血管壓力和心率無明顯差異[7]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)氣管和肺泡細(xì)胞內(nèi)存在強(qiáng)烈的PGIS免疫反應(yīng)，重復(fù)給予MCT-PAH鼠PGIS基因轉(zhuǎn)染可減弱肺血管重構(gòu)，提高其存活率（P＜0.01）。2.4肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）是目前已知的生物活性最廣泛的生長(zhǎng)因子之一，具有抗纖維化、修復(fù)損傷肺組織等潛能。經(jīng)野百合堿注射構(gòu)建的MCT-PAH鼠體內(nèi)存在內(nèi)源性HGF的顯著下降，而肺微動(dòng)脈內(nèi)膜上有豐富的c-Met/HGF受體。將HGF基因轉(zhuǎn)染MCT-PAH鼠，3w后測(cè)定發(fā)現(xiàn)其肺動(dòng)脈內(nèi)膜和平滑肌細(xì)胞的過度異常增生受到抑制。研究者推測(cè)HGF缺乏是PAH的病因之一，補(bǔ)給HGF可降低肺動(dòng)脈壁厚度，減少肺組織的膠原沉積，延緩PAH進(jìn)展[8]。此外，PGIS基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染可增強(qiáng)HGF在肺組織的表達(dá)，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NOS和ET-1的聚集，促進(jìn)肺血管生成，緩解PAH的臨床癥狀[9]。3特殊類型PAH的基因診治3.1艾滋病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓（HIV-relatedPAH，HRPH）基因診斷HRPH的發(fā)病機(jī)制尚不確切，目前相關(guān)的假說包括：炎性介質(zhì)作用、遺傳因素、鉀離子通道過度抑制等。遺傳因素方面，Almodovar等[10]提出調(diào)控蛋白Nef可能在HRPH的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。HIV-1型基因編碼的HIV-1Nef是一種具有廣泛作用的銜接蛋白，可影響HIV感染性和非感染性肺血管組織。3.2艾滋病相關(guān)性肺動(dòng)脈高壓（HRPH）基因治療基因治療HRPH的研究近年來相繼開展，HIV蛋白酶抑制劑（HIVproteaseinhibitors，HPIs）被認(rèn)為是有潛力的基因靶點(diǎn)。Gary-Bobo[11]構(gòu)建了MCT-PAH鼠，每天給予實(shí)驗(yàn)組HPIs樣品（利托那韋30mg/kg，安普那韋100mg/kg，奈非那韋500mg/kg），3w后測(cè)定肺動(dòng)脈壓、右心室肥厚指數(shù)、肺血管肌型動(dòng)脈百分比、肺動(dòng)脈壁厚度等參數(shù)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)指標(biāo)較前均有所下降。表明HPIs可能對(duì)肺血管重塑和肺平滑肌細(xì)胞增生有一定療效。4問題和展望4.1基因載體問題基因載體主要有病毒載體和非病毒載體。病毒載體基因轉(zhuǎn)運(yùn)能力強(qiáng)，非病毒載體具有低毒性，外源基因隨機(jī)整合率低，攜帶的基因大小不受限制等優(yōu)點(diǎn)?；蛟\治要求選擇具備易于構(gòu)建、操縱和整合、攜帶基因容量不受限、高效表達(dá)、安全性好等性能的基因載體，以達(dá)到靶基因持久、高效、精確表達(dá)的目的。4.2安全性問題現(xiàn)使用最廣泛的基因載體是腺病毒載體，盡管已去除其病原性，其安全性仍是目前的首要問題。有報(bào)道指出，某些腺病毒的亞型可誘發(fā)炎癥或免疫反應(yīng)，還可能激活某些原癌基因，產(chǎn)生致畸、致癌的副作用。鑒于這一點(diǎn)，人們開展了非病毒載體的研究，目前尚無定論。4.3實(shí)際運(yùn)用涉及的問題基因診療作為醫(yī)學(xué)診療的新領(lǐng)域，涉及的倫理和費(fèi)用問題是廣大醫(yī)療工作者和患者共同關(guān)心的。例如，試圖通過基因工程改變正常人遺傳特征的想法備受爭(zhēng)議?？偠灾蛟\治技術(shù)作為一種新型手段在肺動(dòng)脈高壓診療中的價(jià)值是不可忽視的，如何進(jìn)一步解決現(xiàn)有的各種問題并開展后續(xù)的臨床試驗(yàn)，是研究工作的當(dāng)務(wù)之急。相信在不久的將來，基因技術(shù)在肺動(dòng)脈高壓中的運(yùn)用能取得突破性的進(jìn)展，肺動(dòng)脈高壓有望實(shí)現(xiàn)治愈。參考文獻(xiàn)：[1]Vattulainen，S.AccurategeneticdiagnosisofFinnishpulmonaryarterialhypertensionpatientsusingoligonucleotide-selectivesequencing[J].MolGenetGenomicMed，2015，3（4）：354-362.[2]Momose，Y.，etal.，DenovomutationsintheBMPR2geneinpatientswithheritablepulmonaryarterialhypertension[J].AnnHumGenet，2015，79（2）：85-91.[3]Gore，B.KeyroleoftheendothelialTGF-beta/ALK1/endoglinsignalingpathwayinhumansandrodentspulmonaryhypertension[J].PLoSOne，2014，9（6）：100310.[4]Caruso，P.DynamicchangesinlungmicroRNAprofilesduringthedevelopmentofpulmonaryhypertensionduetochronichypoxiaandmonocrotaline[J].ArteriosclerThrombVascBiol，2010，30（4）：716-723.[5]Zhao，Y.Y.andA.B.Malik，Anovelinsightintothemechanismofpulmonaryhypertensioninvolvingcaveolin-1deficiencyandendothelialnitricoxidesynthaseactivation[J].TrendsCardiovascMed，2009，19（7）：238-242.[6]Farkas，L.VEGFamelioratespulmonaryhypertensionthroughinhibitionofendothelialapoptosisinexperimentallungfibrosisinrats[J].JClinInvest，2009，119（5）：1298-1311.[7]Gubrij，I.B.Attenuationofmonocrotaline-inducedpulmonaryhypertensionbyluminaladeno-associatedvirusserotype9genetransferofprostacyclinsynthase[J].HumGeneTher，2014，25（6）：498-505.[8]Hiramine，K..Hepatocytegrowthfactorimprovesthesurvivaloftheameliorationofpulmonaryhemodynamics[J].IntJMolMed，2011，27（4）：497-502.[9]Liu，R..Transfectionofhumanhepatocytegrowthfactorgeneinhibitsadvancingpulmonaryarterialhypertensioninducedbyshuntflowinarabbitmodel[J].TransplantProc，2013，45（2）：705-712.[10]Almodovar，S.PathogenesisofHIV-