生物學基本技能 教案Ⅺ 染色劑和染色

基本技能Ⅺ染色劑和染色一、目標與任務本次教學主題基本技能Ⅺ染色劑和染色學時授課班級授課日期授課地點主講教師實驗目的1.規(guī)范操作常用的染色技術。2.掌握常用染色劑的配制方法技能分解生物學常用的染料常用染液的配制常用的生物學染色技術實驗操作實訓思政元素遵循操作規(guī)范；追求科學、創(chuàng)新，提升成就感教學方法講授法、演示法、討論法、案例分析法、課堂觀摩法、實訓法教學媒體教材、課件、教案、多媒體、投影儀二、教學進度教學過程教學內(nèi)容教學活動教學時間（分鐘）教師活動學生活動理論知識講授一、生物學常用的染料（一）天然染料天然染料主要來源于植物、動物、微生物或天然彩色礦石，其特征是一般可以自然降解，大部分無毒性，不污染環(huán)境。生物學實驗所用的天然染料多為植物染料?！ぬK木精（hematoxylin）。是南美的蘇木（熱帶豆科植物）干枝中用乙醚浸漬出來的一種色素，是最常用的染料之一。蘇木精不能直接染色，被染材料必須經(jīng)金屬鹽的媒劑作用后才有著色力，所以在配制蘇木精染色時一般都要用媒染劑。常用的媒染劑有硫酸鋁銨（銨明礬）、硫酸鋁鉀（鉀明礬）等。蘇木精是染細胞核的優(yōu)良材料。用酸性溶液（如鹽酸\|酒精）分化后呈紅色，水洗后仍恢復青藍色；用堿性溶液（如氨水）分化后呈藍色，水洗后呈藍黑色?！ぱ蠹t（carmine）。又叫胭脂紅或卡紅，是將一種產(chǎn)自熱帶的雌性胭脂蟲干燥后，磨成粉末，提取出蟲紅，再用明礬處理，除去其中雜質(zhì)而制成的染料。單純的洋紅不能染色，要經(jīng)酸性或堿性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，堿性溶液有氨水、硼砂等。洋紅是細胞核的優(yōu)良染料，適于小型材料的整體染色?！しt（safranine）。是從藏紅花柱頭中提取的一種天然染色劑，為橙紅色粉末，可溶解于水和乙醇。常用于組織學和細胞學的生物染色，能對植物的木質(zhì)化、栓質(zhì)化和角質(zhì)化部分進行染色，能將細胞核、染色體和花粉外壁等染成鮮艷的紅色，其常與固綠等進行合作染色。番紅在分析化學中也被用作氧化還原指示劑。（二）人工染料人工染料主要是人工合成的一類染料，其缺點是經(jīng)日光照射后容易褪色，苯胺藍、亮綠、甲基綠更易褪色。在制片中注意掌握酸堿度，并避免日光直射，能保持多年不褪色。二、常用染液的配制（一）呂氏（Loeffer）堿性美藍染液配制（三）革蘭氏（Gram）染液配制（1）草酸銨結晶紫染液（2）盧戈（lugol）碘液（3）脫色液：95%乙醇溶液。（4）番紅復染液（四）芽孢染液（sporestainingsolution）配制（1）孔雀綠染液（2）番紅水溶液（3）苯酚品紅溶液（4）黑色素溶液（五）莢膜染液（capsulestainingsolution）配制（1）黑色素水溶液（2）番紅染液：與革蘭氏染液中番紅復染液配制法相同。（六）鞭毛染液（flagellumstainingsolution）配制（1）硝酸銀鞭毛染液（2）Leifson鞭毛染液三、常用的生物學染色技術（一）植物組織染色（planttissuestaining）植物組織染色的常用方法是番紅-苯胺藍（或固綠）二重染色法。（二）植物細胞染色（plantcellstaining）植物細胞的體積微小，且含有較高比例的水，故大多是無色透明的，如果不經(jīng)染色處理，在顯微鏡下難以看清細胞的結構。因此，要觀察某種細胞時，通常先進行染色處理。在普通光學顯微鏡下可見的細胞基本結構一般為細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核等。（1）細胞核染色。植物細胞核的染色常用浮爾根染色法、番紅-結晶紫-橘紅G三重染色法以及蘇木精染色法等。（2）鑒定植物細胞死活。死細胞和活細胞不但透性不同，而且pH等情況也不同，對某些染料的反應明顯不同。某些染料能在活細胞的細胞液中積累，卻不能染活的原生質(zhì)，但能使死細胞的原生質(zhì)染色而不積累于液泡，所以可根據(jù)某些染料活體染色的情況來鑒定細胞死活。（三）植物細胞器染色（plantorganellestaining）在真核細胞中存在著多種具有特殊形態(tài)結構和功能的細胞器，如線粒體、高爾基復合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、中心體、核糖體等。這些細胞器中有的經(jīng)過特殊的染色后在光鏡下就可被觀察到，而有些細胞器由于體積非常小，只有在電鏡下才可觀察到。（1）線粒體染色。線粒體是細胞進行呼吸作用的場所，其形態(tài)和數(shù)量隨不同物種、不同組織器官和不同的生理狀態(tài)而發(fā)生變化。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進行超活染色。這是由于線粒體內(nèi)的細胞色素氧化酶的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)（即有色狀態(tài)），呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質(zhì)中，這些染料被還原為無色的色基（即無色狀態(tài)）。以洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞線粒體的超活染色為例介紹具體操作方法。（2）液泡染色。中性紅為弱堿性染料，對液泡系的染色有專一性，只將活細胞中的液泡染成紅色，細胞核與細胞質(zhì)完全不著色，這可能與液泡中某些蛋白質(zhì)有關。（四）植物細胞染色體染色（plantchromosomestaining）（1）浮爾根染色浮爾根（Feulgen）染色是鑒別細胞核中DNA的組織化學方法,其原理與希夫試劑的化學性質(zhì)有關。以蠶豆根尖細胞染色體染色為例介紹浮爾根染色的具體操作。（2）醋酸洋紅染色（3）鐵明礬-蘇木精染色該染色方法是在根尖細胞有絲分裂染色體計數(shù)中效果最好的一種方法。（4）改良苯酚品紅染色根尖解離后，將根尖放在載玻片中央，用刀片將根冠和伸長區(qū)切除，只留乳白色的分生區(qū)，滴上一滴改良苯酚品紅染液，染色8～15min后，蓋上蓋玻片。用吸水紙放在蓋玻片上，左手按住載玻片，右手拇指在吸水紙上對準根尖部位施加壓力，使材料均勻分散。（五）動物組織染色（肝臟的組織染色法——Mallory苯胺藍染色法）（六）動物細胞染色（animalcellstaining）（1）細胞核染色：常用的染料有甲苯胺藍、蘇木精、胭脂紅、番紅、甲基綠、結晶紫等。以人口腔黏膜上皮細胞為例介紹甲苯胺藍染色法。（2）鑒定細胞死活（臺盼藍染色法）細胞膜喪失完整性，細胞即可被認為已經(jīng)死亡。臺盼藍（trypanblue）是檢測細胞膜完整性最常用的生物染色試劑。健康的正常細胞能夠排斥臺盼藍，而死亡的細胞，膜的完整性喪失，通透性增加，細胞可被臺盼藍染成藍色。依據(jù)此原理，細胞經(jīng)臺盼藍染色后，可通過顯微鏡，直接鏡下計數(shù)或拍照后計數(shù)，實現(xiàn)對細胞存活率比較精確的定量分析。（七）動物細胞器染色（animalorganellesstaining）（1）線粒體染色（人口腔黏膜上皮細胞線粒體的超活染色觀察）（2）高爾基復合體染色高爾基復合體可用硝酸鈾染液、硝酸鈷-硝酸銀染液、氯化鉻-甲醛染液、升汞-鋨酸染液等染色。以硝酸鈷-硝酸銀染液染色法為例介紹高爾基復合體染色步驟。（八）動物染色體染色（animalchromosomestaining）有姬姆薩染色法、苯酚品紅染色法、醋酸洋紅染色法、浮爾根染色法四種。（九）細菌的簡單染色（bacteriasimplestaining）（1）原理在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，堿性染料在電離時，其分子染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色，故可用單一的堿性染料對細菌進行染色。（2）材料和器材儀器：顯微鏡、酒精燈等。實驗材料：菌種為枯草芽孢桿菌、四聯(lián)球菌；染劑為齊氏石碳酸復紅染液。（3）操作步驟（4）結果觀察（十）革蘭氏染色（gramstaining）（1）原理由于細菌細胞壁的結構和組成不同，革蘭氏染色法將細菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。當用結晶紫初染后，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。將碘液作為媒染劑，其能與結晶紫結合成結晶紫和碘的復合物，增強了染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陰性菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇脫色時溶解類脂質(zhì)，增加細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易于滲出，細菌被脫色，再經(jīng)番紅復染后呈紅色。革蘭氏陽性菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。（2）材料和器材儀器：顯微鏡、酒精燈等。實驗材料：菌種為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌；染劑為草酸銨結晶紫染液、番紅染液；媒染劑為碘液；脫色劑為95%乙醇。（3）操作步驟（4）結果觀察（十一）細菌芽孢染色（bacteriasporestaining）（1）原理芽孢壁厚、通透性差、不易著色，無法用單染色的方法使其著色，用著色力強的染色劑孔雀綠或石碳酸復紅，在加熱條件下染色，染料不僅能夠進入菌體，也能進入芽孢內(nèi)。進入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，當用對比度大的復染色劑染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，使芽孢和菌體更易區(qū)分。（2）材料和器材儀器：顯微鏡、試管、電爐等。實驗材料：菌種為枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌；染液為石碳酸復紅、黑墨汁（需過濾）。（3）操作步驟（4）結果（十二）細菌莢膜染色（bacteriacapsularstaining）（1）原理莢膜是包圍細菌細胞的一層黏液性物質(zhì)，具有明確的外緣，牢固附著在菌體細胞壁外；莢膜的主要成分是多糖，不易著色，其含水量高達90%以上，易變形。莢膜染色通常采用襯托染色法或負染法，即將菌體和背景分別著色，從而把不著色且透明的莢膜襯托出來。（2）材料和器材菌種：褐球固氮菌。染色劑：石碳酸復紅、黑墨汁（已過濾）。其他：載玻片、無菌水、洗瓶、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯、香柏油、接種用具、95%乙醇。（4）結果（十三）細菌鞭毛染色（bacteriaflagellumstaining）（1）原理細菌的鞭毛極纖細，直徑一般為0.1～0.2μm，只有用電子顯微鏡才能觀察到。但是，如采用特殊的染色法，則在普通光學顯微鏡下也能觀察到。鞭毛染色的基本原理：在染色前先用媒染劑(如單寧酸或鉀明礬)處理，讓媒染劑沉積在鞭毛上，使鞭毛直徑加粗，然后再進行染色（如堿性復紅、硝酸銀、結晶紫）。常用的媒染劑由單寧酸和氯化高鐵或鉀明礬等配制而成。（2）材料和器材儀器：顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、凹載玻片、蓋玻片、鑷子、細玻棒、吸水紙等。實驗材料：菌種為枯草芽孢桿菌（鞭毛周生）、銅綠假單胞菌（鞭毛端生）；染液為硝酸銀鞭毛染色劑A液和B液、95%乙醇和蒸餾水。（3）操作步驟（4）結果（十四）細菌抗酸染色（bacteriaacidfaststaining）（十五）細菌細胞壁染色（bacteriacellwallstaining）（十六）淀粉染色（starchstaining）淀粉是白色無定形粉末，由直鏈淀粉（占10%～30%）和支鏈淀粉（占70%～90%）組成。直鏈淀粉能溶于熱水而不呈糊狀。支鏈淀粉不溶于水，熱水與之作用則膨脹而成糊狀。溶于水中的直鏈淀粉呈彎曲形態(tài)，并借分子內(nèi)氫鍵卷曲成螺旋狀，加入碘酒，碘分子便鉆入螺旋當中空隙，與直鏈淀粉結合在一起，從而形成絡合物。這種絡合物能比較均勻地吸收除藍光以外的其他可見光（波長范圍為400～750nm），從而使淀粉變?yōu)樯钏{色。（十七）糖類染色（sugarstaining）（1）斐林試劑。還原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的單糖和某些二糖（如乳糖和麥芽糖）。在堿性溶液中，還原糖能將Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ag+等金屬離子還原，而糖本身被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。糖類的這種性質(zhì)常被用于糖的定性和定量測定。（2）過碘酸希夫反應法。過碘酸是一種強氧化劑，過碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基變?yōu)橐叶┗?，乙二醛基繼而與希夫試劑結合，希夫試劑本為無色亞硫酸品紅復合物，與乙二醛基結合后形成紫紅色反應物。顏色反應的深淺取決于組織內(nèi)多糖（包括糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖脂等）的乙二醇分子的多少。（十八）脂肪染色（fatstaining）脂肪染色可用蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、油紅O、蘇丹黑等進行染色，常用的是蘇丹Ⅲ染色法。（十九）蛋白質(zhì)染色（proteinstaining）常用的蛋白質(zhì)染色試劑有雙縮脲試劑、考馬斯亮藍、銀染、熒光染色及同位素顯色。其中考馬斯亮藍染色法的應用較為廣泛。考馬斯亮藍染色法（coomassiebluestaining）又稱為Bradford法，是Bradford