生物中圖版學(xué)案：第一章第三節(jié)測(cè)定微生物的數(shù)量

學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精學(xué)必求其心得，業(yè)必貴于專精第三節(jié)測(cè)定微生物的數(shù)量掌握測(cè)定特定樣品中的微生物數(shù)量的方法。一、測(cè)定微生物數(shù)量的方法測(cè)定微生物數(shù)量的方法可分為兩類：直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法。1．直接計(jì)數(shù)法（1）方法：常用的是顯微鏡直接計(jì)數(shù)法，先將待測(cè)樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。（2)優(yōu)點(diǎn)：所需設(shè)備簡(jiǎn)單，可迅速得到結(jié)果，而且在計(jì)數(shù)的同時(shí)能觀察到所研究微生物的形態(tài)特征.（3)缺點(diǎn):難以計(jì)數(shù)微小的細(xì)菌.（4）適用范圍:一般適用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。2．間接計(jì)數(shù)法(1）方法：常用的是稀釋平板計(jì)數(shù)法。先將待測(cè)樣品配制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開(kāi)。再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中,使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)；或是將一定量的稀釋液,與溶化后冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待凝。經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，就由單個(gè)微生物生長(zhǎng)繁殖形成菌落，這樣的一個(gè)菌落就代表著一個(gè)微生物個(gè)體。統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基中出現(xiàn)的菌落數(shù),即可推算出檢測(cè)樣品中的活菌數(shù).（2）優(yōu)點(diǎn)：在樣品中含菌數(shù)較少的情形下，也可以完成計(jì)數(shù)。二、實(shí)例1．稀釋平板法計(jì)數(shù)土壤中好氣性細(xì)菌土壤中數(shù)量眾多的微生物對(duì)提高土壤肥力有重要作用,因此，測(cè)定土壤中的含菌量可以作為判定土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo).計(jì)數(shù)時(shí)要選取具有合適菌落數(shù)的稀釋倍數(shù)并計(jì)數(shù)。選擇的原則是：（1）細(xì)菌、放線菌、酵母菌以每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有30～300個(gè)菌落為宜。霉菌以每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)有10～100個(gè)菌落為宜。（2）同一稀釋倍數(shù)各個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差不要太懸殊。統(tǒng)計(jì)出的菌落數(shù)按下列公式計(jì)算,得出每克樣品菌數(shù)。每克土壤樣品菌數(shù)＝eq\f（某稀釋倍數(shù)的菌落平均數(shù)，細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)所用的稀釋液體積)×稀釋倍數(shù)2．檢測(cè)天然水源中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)細(xì)菌總數(shù)通常是指1g或1mL檢測(cè)樣品中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，單位用cfu/g(mL）表示.大腸菌群數(shù)通常是指每100g或100mL檢測(cè)樣品中所含大腸菌群的實(shí)際數(shù)值,以（MPN)表示.大腸菌群是指在37℃條件下,24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣的一類需氧或兼性厭氧型革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌的總稱。大腸菌群數(shù)的檢測(cè)，常用多管發(fā)酵法，使用乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）和乳糖發(fā)酵管。3．土壤中分解尿素細(xì)菌的計(jì)數(shù)有些細(xì)菌含有尿素分解酶，能將尿素瓊脂培養(yǎng)基中的尿素分解生成氨,氨溶于水變成氫氧化銨，導(dǎo)致培養(yǎng)基變成堿性，使酚紅指示劑呈現(xiàn)紅色。思考：土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱,為什么？提示：由于土壤具備了各種微生物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)、水分、空氣、酸堿度、滲透壓和溫度等條件,是微生物生活的良好環(huán)境。對(duì)微生物來(lái)說(shuō)，是微生物的“大本營(yíng)”；對(duì)人類來(lái)說(shuō)，是最豐富的“菌種資源庫(kù)”。1．顯微鏡直接計(jì)數(shù)法與稀釋涂布平板法的比較顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法是將經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋的菌懸液放在血球計(jì)數(shù)板的載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（0。1mm3)，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)?yè)Q算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌和死菌的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速，但需要與血球計(jì)數(shù)板配套使用,且計(jì)數(shù)隨機(jī)性大，所以對(duì)菌體數(shù)量不能做出較為宏觀、全面的反應(yīng)。平板菌落計(jì)數(shù)法通常做梯度稀釋,所以計(jì)數(shù)的線性范圍大。由于是菌懸液涂布,所以比較均勻，能較好地反映菌落的疏密程度，重復(fù)性、平行性好，是經(jīng)典的計(jì)數(shù)方法。但需要平板上長(zhǎng)出菌落一段時(shí)間后才能計(jì)數(shù)，因此速度慢是最大的缺點(diǎn)。2．在土壤中采集菌樣的方法與要點(diǎn)由于在土壤中幾乎可找到任何微生物,所以土壤往往是首選的采集目標(biāo)。土壤采樣必須考慮以下幾個(gè)問(wèn)題：(1）土壤中有機(jī)物的含量：有機(jī)物含量高，土質(zhì)較肥，一般在其中微生物數(shù)量也較多，反之微生物數(shù)量也就較少.（2）采土的深度：土壤的深度不同，其通氣、養(yǎng)分和水分的分布情況也不同.表層的土壤直接受日光曝曬，故較干燥，微生物也不易大量繁殖。在離地面5~20cm處的土壤中，微生物含量最高。(3）植被情況：植被的種類與微生物的分布有著密切的關(guān)系.例如,在冬天灌水的水稻田土壤中，真菌分布得較多.（4）采土的季節(jié)：以春秋兩季為宜。這時(shí)土壤中的養(yǎng)分、水分和溫度都較適宜，微生物的數(shù)量也最多。采土?xí)r尤其應(yīng)注意土壤的含水量，水分過(guò)多會(huì)造成厭氧環(huán)境,不利于放線菌的生長(zhǎng)繁殖.真菌雖需要較高的相對(duì)濕度,但基質(zhì)中的水分卻不宜過(guò)多。因此要避免在雨季采集土樣。此外，土壤的pH也應(yīng)適當(dāng)注意，細(xì)菌和放線菌在中性或微堿性土壤中居多，而真菌則在偏酸性的土壤中較豐富。（5）采土方法：選擇好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小鏟子除去表土，取5～20cm處的土樣幾十克，盛入事先滅過(guò)菌的防水紙袋內(nèi)，并在上面記錄采土?xí)r間、地點(diǎn)和植被等情況.題型一測(cè)定細(xì)菌數(shù)量的原理與方法【例題1】用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確的是（）。A．涂布了1個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230B．涂布了2個(gè)平板,統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C．涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D．涂布了3個(gè)平板,統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、240和250,取平均值233解析:在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性，所以A、B兩項(xiàng)不正確。C項(xiàng)雖涂布了3個(gè)平板,但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另兩個(gè)相差太遠(yuǎn)，說(shuō)明在操作過(guò)程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤,因此，不能簡(jiǎn)單地用3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值求平均值。答案：D反思領(lǐng)悟：在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板作為重復(fù)組；在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí),一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致,如果結(jié)果差別過(guò)大，則意味著操作有誤，需重新實(shí)驗(yàn).題型二特定樣品中微生物數(shù)量的測(cè)定【例題2】在做分離分解尿素的細(xì)菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上篩選出大約150個(gè)菌落，而其他同學(xué)只選擇出大約50個(gè)菌落。A同學(xué)的結(jié)果產(chǎn)生原因可能有()。①由于土樣不同②由于培養(yǎng)基污染③由于操作失誤④沒(méi)有設(shè)置對(duì)照A．①②③B．①②③④C．②③④D．①③④解析：實(shí)驗(yàn)結(jié)論是否正確與是否設(shè)置對(duì)照有直接關(guān)系,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果與是否設(shè)計(jì)對(duì)照無(wú)關(guān)。答案：A1某同學(xué)在101、102、103倍稀釋的平均菌落數(shù)為2760、295和46，則菌落總數(shù)(個(gè)/mL）為（）。A．2.76×104B．2.95×104C．4.6×104D．3。775×104解析:菌落計(jì)數(shù)法，注意是計(jì)算不同稀釋度的平均菌落數(shù).首先選擇平均菌落數(shù)在30~300之間的，當(dāng)只有一個(gè)稀釋倍的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落乘以稀釋倍數(shù)即為該樣品的細(xì)菌總數(shù)；若有兩個(gè)稀釋倍的平均菌落數(shù)均在30～300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來(lái)決定，若比值小于2應(yīng)取兩者的平均數(shù)，若大于2，則取其中較小的菌落總數(shù).本題295、46在30～300之間，46×103與295×102比值為1.6，應(yīng)取二者平均數(shù)(46×103＋295×102）÷2＝3。775×104。若所有稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)均不在30～300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。答案：D2土壤中分解尿素的微生物所需氮源為(）。A．硝酸B．氨C．尿素D．蛋白胨解析：只有能合成尿素分解酶的微生物才能分解尿素，以尿素為氮源，缺乏尿素分解酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖而受到抑制，所以,能夠選擇出分解尿素的微生物。答案：C3下表表示某培養(yǎng)基的配方，下列敘述正確的是（）。成分蛋白胨葡萄糖K2HPO4伊紅美藍(lán)蒸餾水含量10g10g2g0.4g0.065g1000mLA．從物理性質(zhì)看該培養(yǎng)基屬于液體培養(yǎng)基，從用途看該培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基B．培養(yǎng)基中屬于碳源的物質(zhì)主要是葡萄糖,屬于氮源的物質(zhì)是蛋白胨C．該培養(yǎng)基缺少提供生長(zhǎng)因子的物質(zhì)D．對(duì)培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至合適的pH后就可以接種菌種使用解析：從配方可知，該培養(yǎng)基為鑒別培養(yǎng)基，用于鑒別大腸桿菌;碳源主要是葡萄糖，蛋白胨主要是氮源,但同時(shí)又可以為大腸桿菌提供生長(zhǎng)因子;該培養(yǎng)基在使用前不僅要調(diào)節(jié)pH,而且要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌。答案：B4對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是(）。A．在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行B．至少接種一種細(xì)菌C．接種一個(gè)細(xì)菌D．及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)解析:細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律的