生物中圖版學案：第一章第三節(jié)測定微生物的數(shù)量

學必求其心得，業(yè)必貴于專精學必求其心得，業(yè)必貴于專精學必求其心得，業(yè)必貴于專精第三節(jié)測定微生物的數(shù)量掌握測定特定樣品中的微生物數(shù)量的方法。一、測定微生物數(shù)量的方法測定微生物數(shù)量的方法可分為兩類：直接計數(shù)法和間接計數(shù)法。1．直接計數(shù)法（1）方法：常用的是顯微鏡直接計數(shù)法，先將待測樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進行計數(shù),計算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)。（2)優(yōu)點：所需設備簡單，可迅速得到結(jié)果，而且在計數(shù)的同時能觀察到所研究微生物的形態(tài)特征.（3)缺點:難以計數(shù)微小的細菌.（4）適用范圍:一般適用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細胞菌體的計數(shù)。2．間接計數(shù)法(1）方法：常用的是稀釋平板計數(shù)法。先將待測樣品配制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細胞分散開。再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中,使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)；或是將一定量的稀釋液,與溶化后冷卻至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無菌培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待凝。經(jīng)過培養(yǎng)后，就由單個微生物生長繁殖形成菌落，這樣的一個菌落就代表著一個微生物個體。統(tǒng)計培養(yǎng)基中出現(xiàn)的菌落數(shù),即可推算出檢測樣品中的活菌數(shù).（2）優(yōu)點：在樣品中含菌數(shù)較少的情形下，也可以完成計數(shù)。二、實例1．稀釋平板法計數(shù)土壤中好氣性細菌土壤中數(shù)量眾多的微生物對提高土壤肥力有重要作用,因此，測定土壤中的含菌量可以作為判定土壤肥力的一個重要指標.計數(shù)時要選取具有合適菌落數(shù)的稀釋倍數(shù)并計數(shù)。選擇的原則是：（1）細菌、放線菌、酵母菌以每個培養(yǎng)皿內(nèi)有30～300個菌落為宜。霉菌以每個培養(yǎng)皿內(nèi)有10～100個菌落為宜。（2）同一稀釋倍數(shù)各個重復的菌落數(shù)相差不要太懸殊。統(tǒng)計出的菌落數(shù)按下列公式計算,得出每克樣品菌數(shù)。每克土壤樣品菌數(shù)＝eq\f（某稀釋倍數(shù)的菌落平均數(shù)，細菌培養(yǎng)時所用的稀釋液體積)×稀釋倍數(shù)2．檢測天然水源中細菌總數(shù)和大腸菌群數(shù)細菌總數(shù)通常是指1g或1mL檢測樣品中所含細菌菌落的總數(shù)，單位用cfu/g(mL）表示.大腸菌群數(shù)通常是指每100g或100mL檢測樣品中所含大腸菌群的實際數(shù)值,以（MPN)表示.大腸菌群是指在37℃條件下,24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣的一類需氧或兼性厭氧型革蘭氏陰性無芽孢桿菌的總稱。大腸菌群數(shù)的檢測，常用多管發(fā)酵法，使用乳糖膽鹽蛋白胨培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）和乳糖發(fā)酵管。3．土壤中分解尿素細菌的計數(shù)有些細菌含有尿素分解酶，能將尿素瓊脂培養(yǎng)基中的尿素分解生成氨,氨溶于水變成氫氧化銨，導致培養(yǎng)基變成堿性，使酚紅指示劑呈現(xiàn)紅色。思考：土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱,為什么？提示：由于土壤具備了各種微生物生長所需的營養(yǎng)、水分、空氣、酸堿度、滲透壓和溫度等條件,是微生物生活的良好環(huán)境。對微生物來說，是微生物的“大本營”；對人類來說，是最豐富的“菌種資源庫”。1．顯微鏡直接計數(shù)法與稀釋涂布平板法的比較顯微鏡直接計數(shù)法是利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法。此法是將經(jīng)過適當稀釋的菌懸液放在血球計數(shù)板的載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室中，在顯微鏡下進行計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是一定的（0。1mm3)，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計得的是活菌和死菌的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。此法的優(yōu)點是直觀、快速，但需要與血球計數(shù)板配套使用,且計數(shù)隨機性大，所以對菌體數(shù)量不能做出較為宏觀、全面的反應。平板菌落計數(shù)法通常做梯度稀釋,所以計數(shù)的線性范圍大。由于是菌懸液涂布,所以比較均勻，能較好地反映菌落的疏密程度，重復性、平行性好，是經(jīng)典的計數(shù)方法。但需要平板上長出菌落一段時間后才能計數(shù)，因此速度慢是最大的缺點。2．在土壤中采集菌樣的方法與要點由于在土壤中幾乎可找到任何微生物,所以土壤往往是首選的采集目標。土壤采樣必須考慮以下幾個問題：(1）土壤中有機物的含量：有機物含量高，土質(zhì)較肥，一般在其中微生物數(shù)量也較多，反之微生物數(shù)量也就較少.（2）采土的深度：土壤的深度不同，其通氣、養(yǎng)分和水分的分布情況也不同.表層的土壤直接受日光曝曬，故較干燥，微生物也不易大量繁殖。在離地面5~20cm處的土壤中，微生物含量最高。(3）植被情況：植被的種類與微生物的分布有著密切的關系.例如,在冬天灌水的水稻田土壤中，真菌分布得較多.（4）采土的季節(jié)：以春秋兩季為宜。這時土壤中的養(yǎng)分、水分和溫度都較適宜，微生物的數(shù)量也最多。采土時尤其應注意土壤的含水量，水分過多會造成厭氧環(huán)境,不利于放線菌的生長繁殖.真菌雖需要較高的相對濕度,但基質(zhì)中的水分卻不宜過多。因此要避免在雨季采集土樣。此外，土壤的pH也應適當注意，細菌和放線菌在中性或微堿性土壤中居多，而真菌則在偏酸性的土壤中較豐富。（5）采土方法：選擇好適當?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取5～20cm處的土樣幾十克，盛入事先滅過菌的防水紙袋內(nèi)，并在上面記錄采土時間、地點和植被等情況.題型一測定細菌數(shù)量的原理與方法【例題1】用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細菌數(shù)，在對應稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計結(jié)果，正確的是（）。A．涂布了1個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是230B．涂布了2個平板,統(tǒng)計的菌落數(shù)是215和260，取平均值238C．涂布了3個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是21、212和256，取平均值163D．涂布了3個平板,統(tǒng)計的菌落數(shù)分別是210、240和250,取平均值233解析:在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復組，才能增強實驗的說服力與準確性，所以A、B兩項不正確。C項雖涂布了3個平板,但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另兩個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤,因此，不能簡單地用3個平板的計數(shù)值求平均值。答案：D反思領悟：在設計實驗時，一定要涂布至少3個平板作為重復組；在分析實驗結(jié)果時,一定要考慮所設置的重復組的結(jié)果是否一致,如果結(jié)果差別過大，則意味著操作有誤，需重新實驗.題型二特定樣品中微生物數(shù)量的測定【例題2】在做分離分解尿素的細菌實驗時，A同學從對應的培養(yǎng)基上篩選出大約150個菌落，而其他同學只選擇出大約50個菌落。A同學的結(jié)果產(chǎn)生原因可能有()。①由于土樣不同②由于培養(yǎng)基污染③由于操作失誤④沒有設置對照A．①②③B．①②③④C．②③④D．①③④解析：實驗結(jié)論是否正確與是否設置對照有直接關系,但實驗結(jié)果與是否設計對照無關。答案：A1某同學在101、102、103倍稀釋的平均菌落數(shù)為2760、295和46，則菌落總數(shù)(個/mL）為（）。A．2.76×104B．2.95×104C．4.6×104D．3。775×104解析:菌落計數(shù)法，注意是計算不同稀釋度的平均菌落數(shù).首先選擇平均菌落數(shù)在30~300之間的，當只有一個稀釋倍的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則以該平均菌落乘以稀釋倍數(shù)即為該樣品的細菌總數(shù)；若有兩個稀釋倍的平均菌落數(shù)均在30～300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來決定，若比值小于2應取兩者的平均數(shù)，若大于2，則取其中較小的菌落總數(shù).本題295、46在30～300之間，46×103與295×102比值為1.6，應取二者平均數(shù)(46×103＋295×102）÷2＝3。775×104。若所有稀釋倍數(shù)的菌落數(shù)均不在30～300之間，則應以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。答案：D2土壤中分解尿素的微生物所需氮源為(）。A．硝酸B．氨C．尿素D．蛋白胨解析：只有能合成尿素分解酶的微生物才能分解尿素，以尿素為氮源，缺乏尿素分解酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源不能生長發(fā)育繁殖而受到抑制，所以,能夠選擇出分解尿素的微生物。答案：C3下表表示某培養(yǎng)基的配方，下列敘述正確的是（）。成分蛋白胨葡萄糖K2HPO4伊紅美藍蒸餾水含量10g10g2g0.4g0.065g1000mLA．從物理性質(zhì)看該培養(yǎng)基屬于液體培養(yǎng)基，從用途看該培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基B．培養(yǎng)基中屬于碳源的物質(zhì)主要是葡萄糖,屬于氮源的物質(zhì)是蛋白胨C．該培養(yǎng)基缺少提供生長因子的物質(zhì)D．對培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至合適的pH后就可以接種菌種使用解析：從配方可知，該培養(yǎng)基為鑒別培養(yǎng)基，用于鑒別大腸桿菌;碳源主要是葡萄糖，蛋白胨主要是氮源,但同時又可以為大腸桿菌提供生長因子;該培養(yǎng)基在使用前不僅要調(diào)節(jié)pH,而且要進行嚴格的滅菌。答案：B4對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是(）。A．在液體培養(yǎng)基上進行B．至少接種一種細菌C．接種一個細菌D．及時補充消耗的營養(yǎng)物質(zhì)解析:細菌群體生長規(guī)律的