PCR的原理與應用

第二章PCR技術的原理及應用2021/7/11故事發(fā)生在1983年

的春夏之交2021/7/12KaryB.Mullis(1944-)，在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。他原本是要合成DNA引物來進行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。1983年春夏之交的一個晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上萌發(fā)了用兩個引物（而不是一個引物）去擴增模板DNA的想法…...很少有在公司工作的科研人員得

諾貝爾獎，Mullis是其中之一2021/7/13Mullis開車的時候,瞬間感覺兩排路燈就是DNA的兩條鏈，自己的車和對面開來的車象是DNA聚合酶，面對面地合成著DNA，……2021/7/14Mullis的第一個PCR實驗1983年9月中旬。

Mullis在反應體系中加入DNA聚合酶后在37

℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒有看到任何條帶。于是他認識到有必要用加熱來解鏈，每次解鏈后再加入DNA聚合酶進行反應，依次循環(huán)。1983年12月，他終于看到了被同位素標記的PCR條帶。2021/7/152021/7/16第一種高溫菌DNA聚合酶的分離美國黃石國家公園2021/7/17Thermusaquaticus2021/7/18TheThermusaquaticusDNApolymeraseTaqNotpermanentlydestroyedat94oCOptimaltemperatureis72oC2021/7/19耐高溫DNA聚合酶的種類TaqDNA聚合酶(Thermusaquaticus，Cetus/Roche)TthDNA聚合酶(Thermusthermophilus，Toyobo)PfuDNA聚合酶（Pyrococcusfuriosus，Stratagene）Deep

VentDNA聚合酶

(Bio-labs）

TflDNA聚合酶（Thermusflavus，Promega)TliDNA聚合酶(Thermococcuslitoralis，Promega)VentDNA聚合酶

(Bio-labs）

PwoDNA聚合酶(Pyrococcuswoesei，Roche)PfxDNA聚合酶

(Thermococcuskodakaraensis,Invitrogen)DynazymeDNA聚合酶（Thermusbrockianus，F(xiàn)innazyme）FDDNA聚合酶(Thermussterophilus？，復旦大學)Tma,Tne,KOD,……2021/7/110PCR儀器的變遷三個水浴鍋，用手移動（Mullis等人當時用的）電加熱塊＋自來水冷卻（PE，1988）電加熱塊＋內(nèi)置循環(huán)液冷卻（PE，1989）三個加熱塊＋機械手（Stratagene，1994）半導體制冷和加熱（MJ,PE,BioMetra,Eppendrof）溫度梯度,熒光檢測(如Roche的Lightcycler)風加熱Lab-on-chip式的PCR儀(所謂的芯片PCR)中國的狀況1991年出現(xiàn)三個水浴鍋+機械手的原始PCR儀（華美，復日等）現(xiàn)在以半導體（Peltier板）制冷式為主（杭州博日,上海天呈,廈門安普利等）2021/7/111PCR的發(fā)展史1983年春，Mullis發(fā)展出PCR的概念；1983年9月，Mullis用大腸桿菌DNA聚合酶做了第一個PCR實驗，只用一個循環(huán)；1983年12月，用同位素標記法看到了10個循環(huán)后的49bp長度的第一個PCR片斷；1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上發(fā)了一篇論文，方法中用了PCR技術，導致Mullis的文章到處被拒；1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準（專利號4,683,202），這回Mullis是第一發(fā)明人。1986年5月，Mullis在冷泉港實驗室做專題報告，全世界從此開始學習PCR的方法；1986年6月，Cetus公司純化了第一種高溫菌DNA聚合酶，TaqDNApolymerase，這是85年春天Mullis建議做的；1988年，第一臺PCR儀問世；1991年，HoffmanLaRoche以3億美元的代價從Cetus公司獲得全權開發(fā)權。2021/7/112PCR不只是一個方法改進Mullis的上司有句“名言”，“我們要擴增這么多DNA樣品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3億美元的轉(zhuǎn)讓費將PCR相關專利轉(zhuǎn)讓給瑞士HoffmanLaRoche公司，并在此后的經(jīng)營中又獲得了數(shù)億美元的分紅；Mullis于1993年獲得諾貝爾化學獎，PCR和DNA重組技術一樣意義深遠。2021/7/113PCR相關的術語和產(chǎn)品層出不窮T-vectorHotStartTaqRT-PCRRAPD-PCRDDRT-PCRLM-PCRInversePCRNestedPCRReal-timePCRRACEFlowchipPCRTASMultiplexPCRImmunoPCRAsymmetricPCRLP-PCRNASBARecombinantPCRAFLPSSCPInsituPCRTaqMan/SYBRgreen2021/7/114

1stcycle2ndcycle3rdcycle過程變性引物退火DNA復制（一）PCR的基本原理2021/7/115（二）PCR的種類

1.普通PCR2021/7/116PCR瓊脂糖凝膠電泳最終產(chǎn)物紫外光觀察3-4小時2021/7/117PCR具有極高的靈敏度樣品正對照負對照標準分子量污染是PCR實驗的常見問題。只要實驗室里曾經(jīng)擴增過某個片段，就有可能以后的實驗中發(fā)生污染。因此，做實驗的時候絕對不要忘了負對照。用紫外燈破壞污染物也是一個辦法2021/7/118（二）PCR的種類2.RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptase-PCR)原理：RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。特點：作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo

dT

及基因特異性引物(GSP)中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構的真核細胞mRNA，三種都可。應用：RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，分析基因的轉(zhuǎn)錄水平，細胞中RNA病毒的含量，直接克隆特定基因的cDNA序列。2021/7/119兩步法RT-PCR示意圖一步法RT-PCR示意圖2021/7/120兩步法RT-PCR一步法RT-PCR起始第一鏈cDNA合成使用：起始第一鏈合成使用Oligo(dT)，隨機六聚體，GSP引物GSP引物優(yōu)點優(yōu)點?靈活?方便引物選擇擴增酶同逆轉(zhuǎn)錄酶預先混合擴增酶的選擇轉(zhuǎn)管步驟少，減少污染可能性?困難RT-PCR的優(yōu)化能力?高靈敏度?適用于在單個樣品中檢測幾個mRNA?適用于大量樣品分析一步法和兩步法RT-PCR的比較2021/7/121EcoRI寡聚(dT)12-18隨機6堿基引物R6寡聚(dT)12-18隨機6堿基引物R6mRNA(A)n(T)12-18(A)n(A)n(T)12-18R6R6R6R6R6R6第二鏈合成(A)n(T)12-18(A)nR6R6R6R6R6R6(A)n(T)12-18EcoRI加上EcoRI接頭，磷酸化，cDNA分級cDNA合成完畢，準備連接第一鏈合成cDNA合成過程示意圖2021/7/122cDNA序列的克隆2021/7/123（二）PCR的種類2.NestedPCR：巢式PCR原理：利用兩套PCR引物（巢式引物）對進行兩輪PCR擴增反應。在第一輪擴增中，外引物用以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進行第二輪擴增。優(yōu)點：由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與兩套引物都互補的引物很少）增加了檢測的敏感性；兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性；增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5'RACE）的特異性。應用：一般應用于動物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等。2021/7/124NestedPCR原理示意圖FirstPCRSecondPCR2021/7/125（二）PCR的種類3.InversePCR：反向PCR原理：用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的DNA，以產(chǎn)生適合于PCR擴增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子。PCR的引物同源于環(huán)上核心區(qū)的末端序列，但其方向可使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)。這種反向PCR方法可用于擴增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應用于制備未知序列探針或測定邊側(cè)區(qū)域本身的上、下游序列。

優(yōu)點：可使已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知DNA成幾何級數(shù)擴增。應用：一般應用于未知序列的擴增，有時也用于定點突變。2021/7/126InversePCR原理示意圖2021/7/127（二）PCR的種類4.PCR-RFLP:

多聚酶鏈反應(PCR)-限制性片段長度多態(tài)性

(restrictionfragmentlengthPolymorphism，RFLP)

原理：PCR產(chǎn)物－限制性內(nèi)切酶切－多態(tài)性分析，DNA發(fā)生重排后，酶切位點發(fā)生改變。

優(yōu)點：具有分辯率高，無需標記,重復性好，簡便快速直觀等。主要用于核酸變異性分析與比較,微生物的分群分型分亞型，癌基因分析，遺傳病的診斷等。

局限：只能應用突變引起限制性酶切位點改變的情況下，一次只能完成一個特定位點突變篩選，檢測效率低。2021/7/128PCR-RFLP原理示意圖2021/7/1295.PCR-SSCP：聚合酶鏈反應一單鏈構象多態(tài)性(singlestrandconformationpolymorphism)原理：是將經(jīng)擴增的DNA片段經(jīng)過變性處理，形成單鏈，由于序列不同，單鏈構象就有差異，在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳的遷移率不同，通過與標準物的對比，即可檢測出有無變異。特點：剛建立時是將同位素摻入PCR擴增的產(chǎn)物中，通過放射自顯影顯示結(jié)果。后用銀染取代同位素顯示DNA帶型，大大降低了成本，具有經(jīng)濟、快速、靈敏等特點。1993年起用EB染色法顯示DNA帶型。優(yōu)點：檢測基因變異，具有操作簡便、快速、不需特殊設備，適用于大樣本篩選。己廣泛應用于檢測各種病原體基因的點突變及缺失突變，基因的多態(tài)性分析等。（一）PCR的種類2021/7/130PCR-SSCP示意圖2021/7/131從定性到定量的革命2021/7/132聚合酶鏈式反應(PCR)可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級的擴增。在擴增反應結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進行定性的分析，也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量PCR技術應運而生。普通PCR定量分析的困惑2021/7/133PCR產(chǎn)物生成曲線log[DNA]Cycles2021/7/134log[DNA]Cycles不同樣品有不同的生成曲線2021/7/135實時定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準確的方法。2021/7/136RealTimePCRandConventionalPCRVS2021/7/1375’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq5’3’RepeatDenaturationPrimerAnnealingElongation常規(guī)PCR

ProcessIntheory,productaccumulationisproportionalto2n,wherenisthenumberofamplificationcyclerepeats2021/7/138Realityvs.TheoryAmplificationisexponential,buttheexponentialincreaseislimited:AlinearincreasefollowsexponentialEventuallyplateausTheoreticalRealLifeLogTargetDNA2021/7/139定量的最佳時期Quantitativeinformationcomesfrommonitoringtheearlystagesofamplification.RealLifeDetectorTheoreticalLogTargetDNACycle#2021/7/140普通PCR和熒光定量PCR的區(qū)別常規(guī)PCR是通過電泳對擴增反應的最終產(chǎn)物進行定性分析（定量不準確），無法進行實時檢測；熒光定量PCR是在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法（準確定量）。2021/7/141普通PCR和定量PCR的區(qū)別適用定性分析，不適合定量分析；PCR產(chǎn)物的長度從100bp－數(shù)kb實時檢測:每個循環(huán)都產(chǎn)出熒光信號絕對定量，靈敏度更高PCR產(chǎn)物的長度一般在60-150bps2021/7/142熒光定量PCR的原理基本原理：擴增呈指數(shù)增長，在反應體系和條件完全一致的情況下，樣本DNA含量與擴增產(chǎn)物的對數(shù)成正比。由于反應體系中的熒光染料或熒光標記物(熒光探針)與擴增產(chǎn)物結(jié)合發(fā)光，其熒光量與擴增產(chǎn)物量成正比。因此，通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。熒光化合物分為兩類（1）非特異性的嵌入熒光染料：利用嵌入熒光染料檢測，只是簡單地反映PCR反應體系中總的核酸量，是一種非特異性的檢測方法。（2）特異性熒光(引物)探針：增加了探針的識別步驟,特異性、專一性更高。2021/7/143非特異性的嵌入熒光染料

（Non-specificDNAbindingdyes）SYBR?GreenISYBR?GoldEthidiumBromide2021/7/144Real-TimePCR，SYBRgreenCycle1Cycle3Cycle2MolecularProbe公司的一個專利產(chǎn)品，USPatent5,436,134

1993年7月12日申請2021/7/145SYBRgreen的優(yōu)缺點簡便可以使用已有的引物普遍通用可以檢測所有的雙鏈DNA，包括引物二聚體；需要化大力氣優(yōu)化反應條件，以消除非特異性擴增；價格

$1/PCR反應定量的靈敏度有所欠缺2021/7/146Extension5’3’5’3’5’3’5’3’ExtensionContinuedApplyExcitationWavelength5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’RepeatDNAbindingdyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll2021/7/147特異性的熒光探針特異性的熒光探針是把熒光化合物標記到特異性的寡核苷酸上形成熒光標記的DNA探針。通過探針與PCR產(chǎn)物特異性的結(jié)合,在PCR過程中可對產(chǎn)物實現(xiàn)均相、實時、定量檢測,也適用于多通道檢測。TaqMan探針2021/7/148定量PCR，TaqMan體系ABI公司首先推出(PRISM7000系列)USPatent5,723,591,

1995年11月申請。實時檢測:每個循環(huán)都會產(chǎn)生與PCR產(chǎn)物成正比的熒光物質(zhì)2021/7/149TaqMan探針是一段5’端標記報告熒光基團(R),3’端標記淬滅熒光基團(Q)的寡核苷酸,其序列與模板DNA中的一段完全互補。當探針單獨存在時,由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生,R的熒光受到Q的猝滅。在PCR過程中,由于TaqDNA酶的5’-3’外切酶活性的作用,使探針的5’端的R被切斷,加大了與Q的距離而使熒光恢復。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加,釋放出來的熒光基團不斷積累。因此,Taqman探針檢測的是積累熒光。2021/7/150Cleavage-basedassay:TaqManTM5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ2021/7/1515’3’5’3’5’3’RQExtensionStep5’3’1.StrandDisplacementTaq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.Cleavage3.PolymerizationComplete5’3’QTaqR3’5’4.Detection5’3’3’QTaqR5’lRCleavage-basedassay:TaqManTM2021/7/152Cycle一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。

為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值。2021/7/153CtvalueandReal-TimeQuantitativePCRTheoryCt值(ThresholdCycle)

PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物熒光信號超過基線值（進入指數(shù)增長期）時的循環(huán)數(shù)。2021/7/154principleofquantitativereal-timePCR…

use

when

ratherthan

howmuchfluorescentsignal

PCRcycles

Low

(highcopyno.)HighCT

(lowcopyno.)real-timePCRamplificationplots(7x10-folddilns.+NTC)Endpoi