DB32-T 3762.21-2023 新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范 第21部分：污水樣本病毒富集濃縮和檢測(cè)

ICS13.100CCSC50江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T3762.21—2023新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第21部分：污水樣本病毒富集濃縮和檢測(cè)SARS?CoV?2detection—Part21：Concentrationanddetectionofvirusinsewagesamples2023-07-25發(fā)布2023-08-25實(shí)施江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布ⅠDB32/T3762.21—2023前言 Ⅲ1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14檢出限與回收率 15環(huán)境與設(shè)施 16設(shè)備與耗材 27試劑與材料 28污水樣本富集濃縮 29核酸檢測(cè) 310標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 311污水新冠病毒濃度定量 312回收率計(jì)算 313質(zhì)量控制 414結(jié)果與報(bào)告 4ⅢDB32/T3762.21—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB32/T3762《新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》的第21部分。DB32/T3762已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：生物樣本采集、運(yùn)輸和保存；——第2部分：病毒分離與鑒定；——第3部分：核酸熒光PCR檢測(cè)程序；——第4部分：重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增程序；——第5部分：血清IgM和IgG抗體酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)程序；——第6部分：血清IgM和IgG抗體膠體金免疫層析檢測(cè)程序；——第7部分：空氣樣本檢測(cè)與評(píng)估；——第8部分：物體表面檢測(cè)與評(píng)估；——第9部分：醫(yī)務(wù)人員職業(yè)暴露檢測(cè)與評(píng)估；——第10部分：微量血清中和試驗(yàn)；——第11部分：全基因組高通量測(cè)序；——第12部分：藥物體外抗病毒效果測(cè)定；——第13部分：疊氮溴化丙錠-熒光PCR檢測(cè)程序；——第14部分：N亞基因組熒光PCR檢測(cè)程序；——第15部分：血清/血漿IgM和IgG抗體磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)程序；——第16部分：核酸數(shù)字PCR法；——第17部分：核酸檢測(cè)用假病毒陽(yáng)性質(zhì)控品；——第18部分：規(guī)?；怂釞z測(cè)程序；——第19部分：全自動(dòng)核酸快速一體化檢測(cè)；——第20部分：核酸熒光PCR檢測(cè)質(zhì)量控制；——第21部分：污水樣本病毒富集濃縮和檢測(cè)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、北京大學(xué)分子工程蘇南研究院、蘇州市疾病預(yù)防控制中心、無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心、揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心、常熟市疾病預(yù)防控制中心、未名環(huán)境分子診斷（常熟）有限公司、南京醫(yī)科大學(xué)。1DB32/T3762.21—2023新型冠狀病毒檢測(cè)技術(shù)規(guī)范第21部分：污水樣本病毒富集濃縮和檢測(cè)本文件規(guī)定了污水樣本中新型冠狀病毒富集濃縮和檢測(cè)方法。本文件適用于生活、醫(yī)療、商業(yè)和工業(yè)等污水樣本中的新型冠狀病毒的濃縮富集和檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS/T799—2022污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)3術(shù)語(yǔ)和定義以下術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。裂解法pyrolysismethod利用裂解鹽使污水中病毒核酸與蛋白分離，高鹽條件下的污水通過濾膜，其核酸樣本被膜吸附，完成富集過程，利用低鹽條件將吸附的核酸樣本從膜上洗脫，再進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)分析。濃縮富集后回收樣本的總拷貝數(shù)與原污水樣品中接種的病毒總拷貝數(shù)之比。4檢出限與回收率富集濃縮采用裂解法時(shí)，方法的檢出限為1copy/mL，N靶標(biāo)的回收率為16%~65%，ORF1ab靶標(biāo)的回收率為10%~48%。5環(huán)境與設(shè)施富集濃縮和檢測(cè)等操作應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL?2）進(jìn)行，同時(shí)采用不低于生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)。實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的所有廢棄物（包括剩余水樣）均應(yīng)經(jīng)有效滅菌后再按醫(yī)療廢棄物進(jìn)行分類處理。新冠病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足GB19489。2DB32/T3762.21—20236設(shè)備與耗材計(jì)（精度≥0.01）、水浴鍋、多孔真空抽濾裝置、滾軸搖勻儀、電子天平（分辨力不低于0.001g）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀或數(shù)字PCR儀。N95及以上防護(hù)口罩、醫(yī)用無(wú)紡布帽、護(hù)目鏡、連體防護(hù)服、一次性PE手套、一次性手術(shù)衣、乳膠手7試劑與材料100mmol/LEDTA配制方法：稱取12.11g三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥99%3.36g乙二胺四乙酸二鈉（純度≥99%置于燒杯中，加入70mL水，攪拌溶解后轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，用鹽酸將pH調(diào)至7.2，定容至100mL）。注：其他材料參照所用病毒核酸提取、擴(kuò)增試劑盒。8污水樣本富集濃縮8.1樣本滅活樣本滅活按照WS/T799—2022中第6章執(zhí)行。用大容量電動(dòng)移液器移取40mL滅活后的污水樣本于50mL無(wú)菌離心管中，加入9.35gNaCl和400μLTE緩沖液，使用滾軸搖勻儀震蕩混合，直至NaCl固體完全溶解。多孔真空抽濾裝置上依次接1μm玻璃纖維膜和50mL注射器套管，無(wú)菌錐形瓶放置于真空抽濾裝置內(nèi)對(duì)應(yīng)位置。打開真空泵，在負(fù)壓條件下將上述樣品過濾收集到無(wú)菌錐形瓶中。關(guān)掉真空泵，打開閥門釋放壓力，取出錐形瓶，在濾液中加入40mL70%乙醇，振蕩搖勻，室溫靜置5min。注：未配備多孔真空抽濾裝置的實(shí)驗(yàn)室可使用常規(guī)固相萃取裝置代替，完成預(yù)過濾和富集濃縮步驟；未配備滾軸搖勻儀的實(shí)驗(yàn)室可手動(dòng)搖勻，促進(jìn)NaCl固體的溶解。3DB32/T3762.21—20238.3富集濃縮多孔真空抽濾裝置上依次連接核酸富集柱、增量管。打開真空泵，形成負(fù)壓。將濾液與乙醇混合樣混勻后，倒入增量管中，通過核酸富集柱完成濃縮步驟。注：如污水樣品較為渾濁，過濾速度慢或發(fā)生堵塞，可使用新的核酸富集柱進(jìn)行替換，完成富集過程，同一污水樣本所有的核酸富集柱的洗脫液作為該污水樣本的濃縮液。待樣品濃縮完成后，關(guān)掉真空泵，打開閥門釋放壓力，回收核酸富集柱。核酸富集柱置入配套離心管中，將無(wú)核酸酶水加入到柱膜中間，靜置3min~5min后，4℃條件下12000r/min離心1min，收集洗脫液，最終獲得的洗脫液即為該污水樣本的濃縮液。后續(xù)可依據(jù)病毒核酸提取試劑盒說明完成提取步驟。注：依據(jù)病毒核酸提取試劑盒所加入樣本量體積，確定加入核酸富集柱無(wú)核酸酶水體積，兩者體積可保持一致。洗脫的濃縮液為原始核酸樣本，如果當(dāng)天能完成提取和擴(kuò)增步驟時(shí)，濃縮液4℃保存；或冷凍在-80℃以備日后檢測(cè)。9核酸檢測(cè)富集濃縮后樣本的新冠病毒核酸檢測(cè)按照WS/T799—2022中第8章執(zhí)行。10標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立污水中病毒核酸的濃度需通過標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣本應(yīng)與目標(biāo)實(shí)驗(yàn)的樣本匹配，即相同的總RNA樣本。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析的稀釋范圍或動(dòng)態(tài)范圍應(yīng)涵蓋實(shí)驗(yàn)樣本預(yù)期的濃度范圍。本文件中可選用新冠病毒核酸基因組標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。將已知病毒核酸濃度的樣本進(jìn)行連續(xù)10倍或5倍梯度稀釋，設(shè)置至少6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度至少做3個(gè)樣本平行，2個(gè)擴(kuò)增平行。以已知的連續(xù)稀釋濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，該濃度對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)滿足R2≥0.99，擴(kuò)增效率在90%~110%之間。11污水新冠病毒濃度定量當(dāng)污水樣品判定為新冠核酸陽(yáng)性后，可使用數(shù)字PCR儀完成上機(jī)前核酸樣本濃度CS的絕對(duì)定量；如使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)，可使用標(biāo)準(zhǔn)曲線完成定量工作。濃縮處理前污水體積為VSmL，富集后濃縮液體積為VCμL，從濃縮液中取出VEμL進(jìn)行核酸提取，得到的核酸體積為VNμL，對(duì)該核酸樣本進(jìn)行RT?qPCR分析，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本檢出Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，換算為提取后的核酸濃度CS（copies/μL污水中新冠病毒濃度CWW（copies/mL）按公式（1）計(jì)算：CWW=…………（1）注：由于方法回收率受個(gè)體操作、污水基質(zhì)、病毒濃度和試劑盒眾多因素影響，在實(shí)際操作過程中，難以實(shí)現(xiàn)每份污水樣本的方法回收率數(shù)據(jù)的收集，故在此計(jì)算過程中忽略方法回收率的影響。12回收率計(jì)算將已知濃度的新冠病毒假病毒加入到40mL污水中，混合搖勻。后續(xù)步驟與污水樣本檢測(cè)操作保持一致，完成富集濃縮、提取和擴(kuò)增步驟，以該樣本的Ct值換算污水中新冠病毒濃度CWW（單位為copies/mL濃4DB32/T3762.21—2023縮處理前污水體積為VSmL（40mL根據(jù)接種假病毒濃度C0（copies/mL）和接種假病毒體積V0mL，污水濃縮富集過程的回收率R（%